长链非编码RNA在Kaposi肉瘤组织中的表达

刘治全 袁 虎 普雄明

1石河子大学医学院，石河子，832002;2湖南省中医药研究院附属医院，长沙，410006;3新疆维吾尔自治区人民医院，乌鲁木齐,830001

Kaposi肉瘤是一种罕见的低度恶性的血管肉瘤，病因和发病机制尚未完全明确[1]。近年来，随着高通量测序技术的发展，非编码RNA被发现在肿瘤的发病机制中起到一定作用，并成为目前研究的热点，miRNA已经证实与Kaposi肉瘤发生发展有关[2-4]。lncRNA占非编码RNA 80%以上，可能有比miRNA更复杂的作用，许多研究提示其可能成为肿瘤治疗新的靶点[5,6]。本研究通过应用高通量lncRNA芯片技术筛选出Kaposi肉瘤组织与瘤旁正常组织差异表达的lncRNA，聚类(GO)分析筛选出与Kaposi肉瘤相关的 lncRNA，为进一步阐明Kaposi肉瘤的发病机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年3～7月新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科经临床和病理确诊的5例Kaposi肉瘤患者瘤体和瘤旁正常皮肤组织，所有标本一经离体立即投入冻存管中，于液氮中保存。所有患者于取材前3个月未系统使用过免疫调节剂、糖皮质激素等治疗，且停止紫外线光疗及外用药物治疗至少1个月；所有标本均经过2位高年资皮肤病理专家阅片证实。本研究获新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，所有患者均填写卡波西肉瘤流行病调查表，并签署知情同意书。5例Kaposi肉瘤患者中，男3例，女2例；年龄平均(57±20.34)岁；均为维吾尔族；均为经典型Kaposi肉瘤。

1.2 实验材料 样本组织总RNA的提取试剂 RNAiso Plus(TAKARA)，质检Bioanalyzer 2100(Agilent technologies)，RNA纯化试剂盒RNeasy mini kit(QIAGEN)，cRNA合成和标记试剂盒(Agilent technologies)，SYBR Green I(Takara)，紫外分光光度计ND-2000(NanoDrop)， ABI 7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)，lncRNA芯片杂交盒(Agilent technologie)，芯片扫描仪(Agilent technologies)。lncRNA芯片为上海伯豪公司的4×180 k human ceRNA表达芯片。

1.3 实验方法

1.3.1 组织总RNA的抽提和纯化 取液氮冻存的Kaposi肉瘤和瘤旁正常组织，采用TAKARA RNAiso Plus并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提，抽提所得total RNA质检合格后使用RNeasy mini kit和RNase-Free DNase Set进行总RNA的纯化。NanoDrop ND-2000紫外分光光度仪检测样本总RNA，样本OD 260/280均在1.7～2.1，说明RNA纯度高，28 S/18 S≥0.7/OD为合格，满足芯片实验要求，见表1。

表1 测序样本总RNA质检结果

1.3.2 芯片杂交、扫描及数据读取分析 实验样品RNA采用Low Input Quick Amp WT Labeling Kit和标准操作流程对样品总RNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit纯化标记后的cRNA。按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒Gene Expression Hybridization Kit组装好杂交仓，将标记后的样本置于滚动杂交炉中65℃，10 rpm，滚动杂交17 h，杂交cRNA上样量1.65 μg，并在洗缸中洗片，洗片所用的试剂为Gene Expression Wash Buffer Kit。杂交后的芯片采用Agilent Microarray Scanner进行扫描。用Feature Extraction software 10.7读取数据，最后采用R软件中limma包进行归一化处理，分别绘制散点图、火山图和热图，并进行GO分析和KEGG pathway分析。

1.3.3 qRT-PCR 用研磨仪将组织样本研磨均匀，以Takara公司的RNAiso Plus提取总RNA，并用NanoDrop ND-2000紫外分光光度仪测定产物的浓度和纯度。按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)的说明书进行逆转录合成cDNA。以人β-actin为内参基因，用SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)在美国ABI 7500系统中进行PCR扩增，实时采集荧光信号用ΔCt值代表基因的相对定量值，用 2-ΔΔCt值表示基因表达的差异倍数：ΔCt值=样本基因的Ct值-同组β-action的Ct值，ΔΔCt值=各个样本的ΔCt值-瘤旁正常组织的ΔCt值的平均值。引物序列：lnc-PXDN-3:3的上游序列ACCTTCCAGCCTTTGTCCTT，下游序列TACCCGAGCATCCACTTAGG；lnc-PERP-10:2的上游序列TCTCCCAGCCTCTCAAAACAG，下游序列AAACCAAGACCCTTCTACCTCTGA；β-action的上游序列TGACTTCAACAGCGACACCCA，下游序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。

1.4 统计学方法 以SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用独立样本t检验分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本总RNA抽提质检结果 根据OD 260/OD 280(260 nm代表核酸的值，280 nm为蛋白质的值)，该比值介于1.7～2.0时判定该样本总RNA质量合格。RNA Integrity Number(RIN)代表总RNA的完整性，RIN≥7.0为完整性好，RIN在6.0～7.0表示存在部分降解，RIN<6.0表示RNA降解。28S/18S≥0.7为合格。所有样本RNA质检均合格。

2.2 lncRNA在Kaposi肉瘤中差异表达谱分析 通过lncRNA微阵列芯片检测比较Kaposi肉瘤皮损及皮损旁组织之间差异表达的lncRNA表达谱。比较Kaposi肉瘤组织及正常组织中的lncRNA表达水平，将差异表达倍数≥1.5且P<0.05的lncRNA定义为差异表达lncRNA,结果筛选出差异表达lncRNA共717个，其中在Kaposi肉瘤组织中上调表达的lncRNA有408个，下调表达的有309个。部分差异表达的lncRNA，见表2。

2.3 lncRNA差异表达聚类图 lncRNA在Kaposi肉瘤组织标本(group 1,g1)和瘤旁正常组织标本(group 2,g2)中呈离散分布(图1)。以差异倍数≥1.5且P<0.05为筛选标准筛选出Kaposi肉瘤组织与正常组织差异表达的lncRNA，其中红色区域表示表达上调和蓝色区域表示表达下调(图2)。聚类分析直观显示每个样本中不同lncRNA的表达水平，红色表示高表达转录本，绿色表示低表达转录本，灰色部分表示无显著性差异，两组样本中lncRNA的表达存在差异(P<0.05)，见图3。

2.4 qRT-PCR验证 为进一步验证基因芯片结果，选取差异lncRNA：lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2， 采用qRT-PCR在原有5对组织标本中检测lncRNA表达水平，结果发现表达趋势与芯片结果一致，每个实验进行3个生物学重复，差异均有统计学意义，间接证明芯片分析数据结果的可靠性。见表3。

2.5 差异表达的lncRNA的靶基因预测 对于lncRNA靶向位点的预测，我们先依据人类不同lncRNA数据库，结合芯片注释给出的lncRNA编号名称以及坐标，获取差异表达的lncRNA序列。选取与lncRNA距离小于10 kb的基因作为顺式作用元件(cis-elements)靶基因；再选出与差异表达的lncRNA序列具有互补性或相似性的序列，利用RNAplex计算两序列之间的互补能量，选择e≤-30的序列作为反式作用因子(trans-elements)作用靶基因，部分结果见表4。然后，根据生物信息学分析，对cis调控及trans调控的靶基因进行KEGG通路注释(图4、5)。

图1 Kaposi肉瘤和瘤旁组织差异表达的lncRNA散点图

图2 Kaposi肉瘤和瘤旁组织差异表达的lncRNA火山图

表2 Kaposi肉瘤组织中部分差异表达的lncRNAs

图3 Kaposi肉瘤组织与瘤旁正常组织差异表达的lncRNA聚类分析图

表3 Kaposi肉瘤组织和瘤旁正常组织中2个lncRNA的表达差异

表4 Kaposi肉瘤组织部分差异表达的lncRNAs的靶基因预测

图4 Cis靶基因富集KEGG通路分析图 图5 Trans靶基因富集KEGG通路分析图

3 讨论

Kaposi肉瘤是一种多发性特发性血管肉瘤，好发于双下肢和足部的皮肤，内脏少见，发展缓慢，临床上分为四型：经典型、艾滋病相关型(AIDS-KS)、非洲型和免疫抑制型。其病因未明，Kaposi肉瘤病毒感染(KSHV)是目前比较明确的病因之一，它编码了12种成熟miRNA,其中kshv-mir-k12-1和kshv-mir-k12-12在Kaposi肉瘤组织中呈高表达[7]，kshv-mir-k12-1-5p可能通过靶向抑制CDKN1A 的表达影响Kaposi肉瘤的细胞周期。然而，不是所有感染KSHV者都会发生Kaposi肉瘤,人内源性逆转录病毒K(HERV-K)的活化可能起到了一定的促进作用，而且并非所有的Kaposi肉瘤都存在KSHV感染[8]。Kaposi肉瘤发生有明确的地区分布和种族差异，在我国主要发生于新疆地区维吾尔族人群中，吴秀娟等[9]对该地区Kaposi肉瘤组织进行miRNA芯片研究，发现了差异表达的miRNA，进一步研究提示miR-126可能是Kaposi肉瘤的一种抑癌基因。

目前研究表明有超过90%的人类基因组可以转录为RNA，但是其中只有2%可翻译为蛋白质，98%的转录产物为不编码蛋白的非编码 RNA，如miRNA、lncRNA等。近年来非编码 RNA 成为研究的热点[10]，而Kaposi肉瘤中的lncRNA与Kaposi肉瘤的关系研究较少。长链非编码 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的线性非编码RNA转录本，可通过顺式(in cis)或反式(in trans)作用调节来调控靶基因的表达。近年来，越来越多的研究证实lncRNA在肿瘤等疾病的发生发展的中发挥着重要作用[11-13]。

本研究通过lncRNA芯片分析了Kaposi肉瘤组织和正常组织中lncRNA表达谱的差异变化，按照表达差异倍数≥1.5倍且P<0.05进行筛选，共得到717个差异表达的lncRNA，其中在Kaposi肉瘤组织中上调409个，下调308个，与正常组织相比，Kaposi肉瘤组织中存在明显的lncRNA差异表达，提示lncRNA可能参与了Kaposi肉瘤的发病过程。

利用生物信息学技术对差异表达的lncRNA进行靶基因预测，结果显示差异表达的lncRNA可能通过cis和trans两种方式对靶基因进行调控。同时我们挑选了在Kaposi肉瘤组织中上调表达的lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2通过qRT-PCR在5对样本组织中进一步验证芯片结果的准确性，结果与芯片检测结果一致。在Kaposi肉瘤lncRNA网络的KEGG功能注释中发现涉及到Wnt信号通路、泛素化代谢、TGF-β信号通路、p53信号通路等，这些信号通路是重要的细胞增殖、分化与凋亡的关键调节通路，与多种肿瘤密切相关。有研究证实乳腺癌中lncRNA CRNDE能通过竞争抑制miR-136激活 Wnt/β-catenin信号，从而促进肿瘤细胞增殖[15]，而lncRNA HIT对TGF-β介导的乳腺癌细胞的侵袭转移具有显著的促进作用[16]。胃癌组织中明显低表达的lncRNA TUSC7，是 p53 的直接转录靶点，可以通过抑制 miR-23b 的方式来抑制肿瘤细胞的生长和增殖[17]。也有研究显示lncRNA可促进蛋白泛素化，增强肿瘤细胞的侵袭能力[18]。抑癌基因转化生长因子II型受体(TGF-βRII)在Kaposi肉瘤瘤体中低表达，考虑与Kaposi肉瘤的发生有关[19]。Chudasama等[20]证实了KSHV的结构蛋白能在裂解后期表达，并被整合到KSHV病毒颗粒中，抵抗p53诱导的细胞凋亡。KSHV基因编码的蛋白能直接或间接作用于多种信号通路，进而参与病毒相关疾病的发病机制中[21]。因此，我们猜想本研究发现的lncRNA通过这些通路作用于KSHV或者Kaposi肉瘤瘤体本身，进而影响Kaposi肉瘤的发生发展，但具体机制仍需要进一步研究。

本实验初步探索lncRNA在Kaposi肉瘤中的表达情况，为进一步研究lncRNA在Kaposi肉瘤发病机制中的作用提供了一定的实验依据，后续我们将深入研究lncRNA在Kaposi肉瘤发病过程中的作用，为Kaposi肉瘤的诊断和治疗提供新的靶点。