1,2,4-丁三醇的双水相萃取

杜宣慧，钱方圆，陆信曜，2，3，宗红，3，诸葛斌，3

（1 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2 非粮生物质酶解国家重点实验室，广西南宁530255；3 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院，工业微生物研究中心，江苏无锡214122）

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol, BT）是一种重要的平台化合物，广泛应用于医药、军工、化妆品等行业[1-2]。目前工业生产BT采用化学法[3]，环境不友好、反应条件苛刻。2003 年，研究人员利用重组大肠杆菌首次实现了BT 的生物合成[1]。近年来，BT 的生物法合成技术在国内外取得了较大进展[4-5]，但有关BT分离提取的报道较少。BT是一种高沸点且高亲水性化合物，传统的分离方法如减压蒸馏、吸附等，难以分离[6]。李敏[6]根据BT 的化学性质，通过羟醛缩合反应，建立了反应萃取-水解耦合工艺分离发酵液中的BT，最后BT的回收率为84%±5%。

双水相萃取法是一种新型的萃取分离技术[7]，具有提取条件温和、界面张力低、周期短、可扩大生产[8-9]等优点。此外，双水相体系中的有机溶剂和无机盐，价格低廉、可回收利用、经济环保。目前双水相萃取分离技术已广泛应用于生物制品[10]、中药[11]和金属离子[12]的分离，而其萃取分离BT还未有报道。本文就双水相萃取分离技术萃取分离BT进行研究，为发酵液中BT的分离提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

蛋白胨、酵母粉，Oxiod 公司；D-1,2,4-丁三醇标准品，阿拉丁试剂(上海)有限公司；卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

5L发酵罐BIOTECH-5BG-7000A，上海保兴生物设备有限公司；高效液相色谱仪P680，美国Dionex 公司；液相色谱柱Aminex HPX-87 column，美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液的制备

菌种来源：E.coliKXW3009，实验室保藏，构建方法和发酵条件见文献[13]。

种子培养基与培养条件（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；1×105Pa 灭菌15min，接种量为1%，温度37℃，转速150r/min，培养时间8h。

发酵培养基与培养条件（g/L）：酵母粉7.5，蛋白胨15，NaCl 15，葡萄糖10，木糖30；1×105Pa 灭菌15min。5L 发酵罐装液量2.5L，10%接种量，葡萄糖初始浓度为10g/L，木糖初始浓度为30g/L，温度37℃，搅拌转速400r/min，通气量为2m3/min，用10mol/L NaOH 溶液控制pH 为6.5。在发酵培养12h 时一次性补加300mL 的84g/L 葡萄糖和252g/L 木糖。发酵结束后将发酵液以4000r/min 离心20min，将离心去除菌体后的上清液保存于4℃冰箱中备用。

1.2.2 BT在不同盐析萃取体系中的分配情况

分别用不同的有机溶剂（甲醇、乙醇、异丙醇）、无机盐[(NH4)2SO4，K2HPO4，NaCl]两两组合形成双水相体系，考察不同双水相体系下BT分配系数和萃取效率。操作如下：体系总质量为10g，离心去除菌体后的发酵液置于离心管中，加入无机盐溶解后添加一定量有机溶剂，旋涡震荡10min，静置10h，待完全分相后，记录上下相体积，检测上下相中BT浓度，计算分配系数和萃取效率。

1.2.3 无水乙醇/K2HPO4双水相相图的绘制

采用浊点法绘制乙醇/K2HPO4相图，考虑到BT对体系的影响，将适量BT 标品加入盐溶液中，根据浊点法[14]绘制相图。

1.2.4 无水乙醇、K2HPO4分数对BT 分配系数的影响

取2g K2HPO4加入到离心后的发酵液中，K2HPO4质量分数为20%，溶解后分别加入质量分数为20%～30%的无水乙醇构成不同的双水相体系，考察不同的无水乙醇质量分数对BT 分配系数和萃取效率的影响。同样，在体系中维持无水乙醇质量分数为28%，向体系加入不同量的K2HPO4（质量分数为20%～30%），考察不同的K2HPO4质量分数对BT分配系数和萃取效率的影响。

1.2.5 pH对BT分配系数的影响

在发酵上清液中加入质量分数为28% 的K2HPO4溶解后，用10mol/L NaOH 和5mol/L H2SO4溶液调节该溶液pH，分别调pH 为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，再加入质量分数为28%的无水乙醇，构建双水相体系，考察不同pH对BT分配系数和萃取效率的影响。

1.2.6 放大实验对BT萃取效率的影响

在最佳萃取条件下[乙醇质量分数为28%、(NH4)2SO4质量分数28%，pH 9.5]，分别将双水相体系质量从10g扩大到100g、500g，考察放大体系对BT萃取效率和分配系数的影响。

1.3 分析方法

BT测定方法见文献[4]。分配系数（K）、BT萃取效率（E）和体积比分别按照式(1)～式(3)计算。

式中，K为分配系数；ρ1、ρ2为上下两相中的BT的质量浓度，g/L；R为相比；Vt、Vb为上下相的体积，mL；E为BT萃取效率，%。

2 结果与讨论

2.1 双水相体系的选择

表1 不同双水相体系下BT的分配系数和萃取效率（有机溶剂/无机盐质量分数20%/20%）

2.2 无水乙醇/K2HPO4双水相相图

相图反映了在一个体系中水溶液两相的形成条件及其定量关系，曲线下方是均相区，在该配比下不会得到分开的两相，曲线上方是两相区，在该配比下可以形成分开的两相[19]。为了解BT 存在的情况下，无水乙醇/K2HPO4中的成相范围，用浊度法绘制无水乙醇/ K2HPO4双水相相图，结果见图1。如图1(a)所示，无水乙醇/K2HPO4双水相体系成相范围广，在K2HPO4质量分数为19.83%～46.87%均可以成相，在两相区内，上相富含无水乙醇，下相富含K2HPO4。当K2HPO4浓度较低时，K2HPO4的盐析效应较弱，导致其难以形成双水相体系，随着K2HPO4的增加，盐析效应增强，当无水乙醇达到一定浓度既可形成双水相体系，并且所需无水乙醇的浓度随K2HPO4浓度的增加而减少。更多K2HPO4的加入，增加了盐析效应，导致对水的竞争能力增强，促进分相[20]。综合考虑无水乙醇和K2HPO4质量分数，实验点从曲线上方的区域选取。

2.3 无水乙醇质量分数对BT萃取效率的影响

选择质量分数为20%的K2HPO4和不同质量分数（20%～30%）的无水乙醇分别组成双水相体系，研究BT 的分配系数和萃取效率的影响见图1(b)。在图1(b)中，最初BT 的萃取效率随无水乙醇质量分数的增加而提高，当双水相体系中K2HPO4和无水乙醇质量分数分别为20%和28%时，BT 的分配系数和萃取效率分别达到6.04 和92.82%，继续增加无水乙醇，萃取效率降低，这与文献[21]结论相似。无水乙醇/K2HPO4双水相体系的分离过程是无水乙醇和K2HPO4争夺水分子的过程，溶剂的水化能力和无机盐的盐析能力直接关系到萃取结果，BT 在该双水相体系下更趋向分配于上相，而无水乙醇用量的增加，上相中水分子增加，下相中水分子减少，下相出现盐析效应，更多的BT被“排出”下相，降低了下相中BT的浓度，提高了BT的分配系数和萃取效率，但过量的无水乙醇会与水互溶，进入下相，带走一部分无水乙醇中的BT，上相的BT 浓度降低，分配系数和萃取效率减小，这也是当无水乙醇质量分数达到30%时，BT 分配系数和萃取效率降低的原因。因此后续实验都采用质量分数28%的无水乙醇进行研究。

图1 无水乙醇/K2HPO4双水相相图及无水乙醇质量分数、K2HPO4质量分数和pH对BT萃取效率的影响

2.4 K2HPO4质量分数对BT萃取效率的影响

考察K2HPO4质量分数对BT的分配系数和萃取效率的影响，用5 组不同的K2HPO4质量分数进行一系列实验，结果如图1(c)所示。相比于无水乙醇质量分数对BT 的分配系数和萃取效率的影响，K2HPO4质量分数的增加对BT萃取效率的提高影响较小，从结果可知，当K2HPO4为28%时萃取效果最佳，当K2HPO4质量分数小于28%时，BT的分配系数随K2HPO4质量分数的增加而提高，但是加入质量分数为30%的K2HPO4时，分配系数降低。因为K2HPO4质量分数的增加，会增加竞争缔合水分子的能力，增强盐析能力，导致更多的水分子进入下相，使上相中BT 的浓度增加，分配系数和萃取效率提高，但是添加过多的K2HPO4，会让BT随水进入下相，反而降低分配系数[22]，因此选择K2HPO4质量分数为28%。

2.5 pH对BT萃取效率的影响

体系pH 的改变会影响两相间的电位差，同时会导致两相带电性质的变化[10]。通过控制体系pH 为5.0～10.0，考察pH 对BT 萃取效率的影响，如图1(d)所示。体系的原始pH 为9.11，在pH＜7.0 时会有大量K2HPO4析出，无法形成双水相体系。在pH＞7.0 时，pH 对BT 的分配系数和萃取效率有较大影响，当pH 为9.5 时，BT 的萃取效率最佳，分配系数和萃取效率分别达到了18.35 和95.87%。BT 为多元醇，电位差的改变对其影响并不大，但发酵液中其他物质在不同pH 下，分离效果不同，越接近其等电点，越容易被分离出来，使得上相中BT 浓度更高，萃取效率和分配系数增加。

2.6 放大体系对BT萃取效率的影响

将原始10g双水相体系放大至100g、500g（因500g 体系较大，震荡方式不合适，所以换成搅拌），考察放大体系对分配系数和萃取效率的影响。从表2可知，随着体系的放大，体系混合不充分，两相分离效果不佳，导致双水相体系萃取BT的分配系数和萃取效率有轻微降低，但是影响不大，说明该方法萃取分离BT 有一定的稳定性，可以放大使用。

表2 放大体系对BT萃取效果的影响

3 结论

采用双水相体系对发酵液中的BT 进行萃取分离，筛选不同的双水相体系，优化有机溶剂和无机盐质量分数、pH 后，得到最佳的双水相体系为无水乙醇/K2HPO4，最佳的萃取条件为：无水乙醇/K2HPO4质量分数比为28%/28%，pH为9.5，分配系数和萃取效率分别为18.35和95.87%。放大实验结果表明，萃取效率和分配系数所受影响不大。采用双水相萃取技术萃取BT的萃取效率高，条件温和，无水乙醇易于回收，可反复利用，经济适用，可为工业采用生物发酵法生产BT 以及其下游分离提供参考。