两种铁皮石斛茶制备工艺的比较研究*

★ 马艳静 张金莲* 任洪民 夏澜婷 王婷 林新明（江西中医药大学 南昌 330004）

铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）为兰科石斛属草本植物，富含多糖、生物碱、微量元素及人体必需的氨基酸等生物活性物质［1］，有医疗与保健双重功效，位列“九大仙草”之首［2］。其干燥茎入药为铁皮石斛，收载于《中国药典》2015年版铁皮石斛项下，具有益胃生津，滋阴清热之功；其花、叶常制成茶使用，不仅可提高铁皮石斛资源的综合利用率，而且可更好的发挥铁皮石斛的药用价值和保健作用。但是目前市场上铁皮石斛叶茶的制备方法不一，工艺参数宽泛，导致品质差异大，且目前未见有相关的文献报导。本文拟通过比较两种制备工艺所得铁皮石斛茶的品质，优选出较优的一种，并进一步采用Box-Behnken效应面法优化，为促进珍稀药材铁皮石斛新产品的开发及铁皮石斛茶的制法的规范化提供一定参考。

1 材料

1.1 药材 铁皮石斛鲜叶由江西省上饶县茶亭镇松坪村铁皮石斛种植基地1、基地2提供，经江西中医药大学葛菲教授鉴定为兰科植物铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）的叶。

1.2 仪器 752-紫外分光光度计（上海光华仪器厂），微波炉（美的集团有限公司），GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），炒锅（美的集团有限公司），HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），SXT-06索氏提取器（上海洪纪仪器设备有限公司）。

1.3 试药 D-甘露糖对照品（纯度98%，批号：wkq16092307），石斛碱对照品（纯度98%，批号：wkq18012501），芦丁对照品（纯度98%，批号：wkq17041004），对照品均购于四川省维克奇生物科技有限公司。苯酚，硫酸，无水乙醇，三氯甲烷，邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液，溴甲酚绿溶液，氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝，所有试剂均为分析纯。娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 制备工艺1 1）冲洗晾干。将不同产地的铁皮石斛鲜叶用流水冲洗，冲洗干净后将铁皮石斛叶均匀摊开，在阴凉避光处晾干。

2）炒青。将晾干铁皮石斛叶利用人工双手在铁锅里炒制至不再出汁为止，铁皮石斛叶经炒青后，经过手工揉搓成条索状，即得杀青后铁皮石斛茶叶，备用。

3）干燥。将杀青后的铁皮石斛茶叶置于干燥箱内，于低温慢焙干即可。

2.1.2 制备工艺2 1）摊放。将铁皮石斛鲜叶洗净后均匀摊放，置于阴凉通风室内，摊放至柔软。

2）杀青。将鲜叶使用微波炉杀青后及时倒入竹匾内，摊晾。

3）炒制干燥。将杀青叶均匀抖散入炒锅内，进行手工炒制，再用干燥箱进行干燥，干透即得。

2.2 铁皮石斛茶叶的质量比较

2.2.1 多糖含量测定［3］

2.2.1.1 供试品溶液的制备 将制备好的铁皮石斛茶叶放于干燥器内；精密称取碾碎后的不同产地铁皮石斛叶或茶叶各0.2 g，加纯水10 mL，在40 ℃、50 Hz的超声波条件下超声提取30 min；续提1次，过滤，55 ℃浓缩至晶体，定容至10 mL，用40 mL无水乙醇进行醇析，4 000 r/min离心5 min；弃去上清液，加纯水25 mL溶解，加savage试剂25 mL除去蛋白、核酸等杂质，1 000 r/min离心5 min，取上清液10 mL置于25 mL容量瓶中，纯水定容，即得多糖提取液。

2.2.1.2 多糖含量测定及标准曲线的绘制 精密称定D-葡萄糖对照品20 mg，置于100 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀。精密移取对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞试管中，加水至2.0 mL，精密加入现配的5%苯酚溶液1.0 mL、摇匀，再加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后静置5 min，90℃沸水浴30 min，冷却至室温，以水为空白，于490 nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=9.708 6X+0.105 6，r=0.999 8。另取“2.2.1.1”项下制备的供试品溶液1.0 mL，自“加水至2 mL开始”，依法测定其吸光度，计算多糖的含量（以葡萄糖计），结果见表1。

2.2.2 总生物碱含量测定［4］

2.2.2.1 供试品溶液的制备 分别精密称取制备好铁皮石斛茶叶各0.4 g，碾碎后，用滤纸包好，于250 mL索氏提取器中，以三氯甲烷100 mL为溶剂，80 ℃回流提取90 min，将提取液浓缩至10 mL，即得叶的总生物碱提取液。

2.2.2.2 总生物碱含量测定及标准曲线的绘制 精密称取1mg的石斛碱对照品，置于100 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀。精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于60 mL的分液漏斗中，加三氯甲烷至10 mL，再加邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液（pH 4.5）5.0 mL、0.04%溴甲酚绿溶液2.0 mL，剧烈振摇5 min后静置30 min，分液。取三氯甲烷层清液5.0 mL，加入0.01 mol/L氢氧化钠乙醇溶液1.0 mL，摇匀，于620 nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，石斛碱浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=0.307 4X-0.026 9，r=0.999 1。另取“2.2.2.1”项下供试品溶液1.0 mL，自“再加邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液（pH 4.5）5.0 mL”起，依法测定其吸光度，计算总生物碱的含量，结果见表1。

2.2.3 总黄酮含量测定［5］

2.2.3.1 样品溶液的制备 分别称取铁皮石斛茶叶0.2 g，碾碎后按料液比1∶20加入65%乙醇，在70 ℃、50 Hz的超声波条件下超声提取30 min；续提1次，过滤，合并滤液，30 %乙醇定容至25 mL，得叶的总黄酮提取液。

2.2.3.2 总黄酮含量测定及标准曲线的绘制 精密称定20 mg芦丁对照品，置于100 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀。精密移取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，加纯水至10 mL，再分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min后加入质量分数为10%的Al（NO3）3溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min后再加人质量分数为4%的NaOH溶液20 mL，混匀，于510 nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，总黄酮浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=0.005 8X+0.000 2，r=0.999 5。另取“2.3.3.1”项下供试品溶液1.0 mL，自“加水至10 mL开始”，依法测定其吸光度，计算总黄酮的含量，结果见表1。

2.2.4 感观指标确定 将两种制备工艺的铁皮石斛茶采用相同的方法进行泡制成茶水，请20位有品茶经验者进行品鉴，确定色泽及口感的优劣。

表1 不同制备工艺铁皮石斛茶品质的比较（n=3）

2.3 Box-Behnken效应面法优选 从“2.2”项下的实验结果显示，制备工艺2的定性指标及多糖、总生物碱、总黄酮含量等定量指标均优于制备工艺1。为得到更好品质的铁皮石斛茶，有必要对制备工艺2的关键工艺参数进行细化和优化，故进一步以基地1铁皮石斛叶为研究对象。采用Box-Behnken 效应面试验［6-12］，结合前期单因素研究的结果，选择摊放时间（A）、微波杀青时间（B）、干燥时间（C）及干燥温度（D）为考察因素，以多糖、总生物碱、总黄酮含量的考察指标，进行Box-Behnken效应面法试验，因素水平表2，实验安排及结果见表3。

表2 铁皮石斛茶叶的提取工艺优选Box-Behnken试验因素水平

表3 铁皮石斛茶叶的提取工艺优选Box-Behnken试验试验安排

以多糖含量（Y1）、总生物碱含量（Y2）、总黄酮含量（Y3）为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件对表3数据进行回归分析，得到回归方程如下：Y1=+0.31+0.100A-2.500E-003B-0.012C+5.833E-003D-2.500E-003AB-2.500EAC-0.025AD+5.000E-003BC+0.020BD-7.500E-003CD-0.11A2-0.064B2-0.073C2-0.054D2（ 相 关 系 数r=0.9573），Y2=+4.28-0.23A-0.11B-0.068C+0.082D+0.037AB-0.040AC-0.19AD-0.022BC+0.098BD-0.10CD-1.13A2-0.14B2-0.16C2-0.28D2（ 相 关 系 数r=0.9767），Y3=+63.58+0.62A+1.31B-0.17C-0.16D+0.22AB-1.53AC-0.60AD-2.84BC+1.58BD-0.12CD-32.61A2-10.82B2-14.32C2-14.16D2（相关系数r=0.9586），说明该模型拟合度良好，试验误差小，可用此模型对铁皮石斛茶提取进行分析和预测。对该模型进行方差分析，结果见表 4～6。

表4 多糖含量回归方程的显著性检验及方差分析

表5 总生物碱含量回归方程的显著性检验及方差分析

表6 总黄酮含量回归方程的显著性检验及方差分析

由表4-6可知，铁皮石斛茶叶多糖、总生物碱及总黄酮含量提取率达极显著水平， 二次项的偏回归系数达极显显著水平，回归方程失拟检验不显著，说明未知因素对实验结果干扰小。拟合检验极显著，说明以上方程与实际情况拟合很好，较好地反映了多糖、总生物碱及总黄酮含量与摊放时间、微波杀青、干燥时间及干燥温度的关系。因此，所得方程能较好的预测铁皮石斛茶叶多糖、总生物碱及总黄酮各参数的变化规律。采用Design-Expert软件作出相应的曲面图和等高线图，见图1-6。

图1 微波杀青与摊放时间对多糖含量影响等高线

图2 微波杀青与摊放时间对多糖含量影响效应面

图3 干燥温度与摊放时间对总生物碱含量影响等高线

图4 干燥温度与摊放时间对总生物碱含量影响效应面

图5 微波杀青与摊放时间对总黄酮含量影响等高线

图6 微波杀青与摊放时间对总黄酮含量影响效应面

由图1-2可知，随着摊放时间及微波杀青时间的变化，最佳多糖含量为摊放时间8 h、微波杀青70 s时多糖含量最高，图3-4可知，最佳总生物碱含量为干燥温度与摊放时间分别为70 ℃、8 h，图5-6可知，最佳总黄酮含量为微波杀青与摊放时间分别为70 s、8 h。以多糖、总生物碱及总黄酮含量均是在干燥时间、干燥温度分别为5 h、70 ℃含量较优。根据二次多项式回归模型的数据分析结果，预测最佳工艺为摊放8 h，微波杀青70 s，70 ℃烘箱中干燥5 h。

2.4 验证试验 取同一批次的铁皮石斛叶，平行3份，按预测最佳工艺进行实验，结果铁皮石斛茶多糖、总生物碱及总黄酮含量分别为0.33、4.38及68.22，RSD值分别为1.57%、1.05%及1.03%，偏差率不显著，表明所建立的模型具有良好预测性，优选的工艺重复性良好。

3 小结

生长环境对铁皮石斛的品质影响很大，本文以两个基地所产铁皮石斛叶为研究对象，分别采用两种工艺进行加工，并以多糖、总生物碱、总黄酮的含量及感观为指标进行比较加工成品的质量，结果显示，石斛茶多糖含量：基地1＞基地2，总生物碱及总黄酮含量：基地1＜基地2，有学者认为多糖为铁皮石斛中最主要的药效成分，也有学者认为总生物碱及总黄酮也有的药用价值，故哪个基地的铁皮石斛叶哪个更优，这有待进一步研究。

由于实验影响因素多，难以实现采用 Box-Behnken效应面法考察全部因素，因此，我们前期采用预试验对一些较重要的工艺因素如摊放时间、微波杀青、干燥时间及干燥温度进行单因素考察，再采用Box-Behnken 效应面法考察这几因素对铁皮石斛茶制备工艺的影响，结果得较优的铁皮石斛茶制备工艺参数为：在温度为20 ℃～25 ℃范围内，以1.0 cm的厚度摊放8 h，微波功率为800 W，投叶量为100 g，厚度为1.0 cm进行杀青，其中杀青时间为70 s时可达到最佳的杀青效果，并获得较高的多糖、总生物碱及总黄酮含量；干燥时，用电炒锅进行，投叶量为100～150 g，下锅温度约为110 ℃，炒制至不再出汁，将炒制后的铁皮石斛叶放置在70 ℃烘箱中干燥5 h，经3批样品的验证，显示预测性较好，为铁皮石斛茶的加工规范化、产业化提供一定的技术支持。