一种基于菲并咪唑的新型次氯酸荧光探针及细胞成像研究

申有名，杨玉芬，谷 标*

(1.湖南文理学院 水处理功能材料湖南省重点实验室，湖南 常德 415000；2.衡阳师范学院 化学与材料科学学院，功能金属有机化合物湖南省高校重点实验室，湖南 衡阳 421008)

作为一种活性氧物质，次氯酸(HClO)/次氯酸根(ClO-)在生物体内起着非常重要的作用。内源性次氯酸由白细胞(包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞)中的髓过氧化物酶催化过氧化氢和氯离子反应而生成[1-2]。研究表明体内正常含量的次氯酸/次氯酸根可维持基本的生命活动，同时在免疫系统中起到防御疾病的作用。然而，异常浓度的次氯酸/次氯酸根(≥1 000 mg/L)则会引起体内生物分子氧化，进而导致各种生理疾病，包括关节炎、动脉粥样硬化、肝硬化和癌症[3-5]。因此，开发一种可靠、有效的次氯酸/次氯酸根检测和成像的方法在生物医学研究和疾病诊断方面具有重要的意义。

在众多方法中，荧光探针因具有灵敏度高、特异性强、操作简单、响应时间快等优点，为体外和体内检测提供了可能[6-7]。迄今为止，已报道了许多以二苯甲酰肼、羟胺、酰肼、对甲基苯酚等作为次氯酸/次氯酸根识别基团的荧光探针[8-10]。然而，用于次氯酸/次氯酸根检测的荧光探针仍存在合成复杂、纯化困难、反应时间长、选择性差等缺点，限制了其应用。因此，研制一种简单、有效、可用于次氯酸/次氯酸根检测和成像的荧光探针十分必要。

菲并咪唑广泛用于有机发光二极管器件，具有较高的荧光量子产率、良好的热稳定性和化学稳定性[11]。更重要的是，该类物质合成简单，且可通过改变苯环取代基种类改变分子内电荷转移过程(ICT)，从而实现荧光信号调控[12-14]。鉴于当前次氯酸/次氯酸根荧光探针存在的诸多不足和菲并咪唑优异的光学性能，本文设计并合成了一种2-(4’-甲基硫基苯基)苯并咪唑(MPI)探针。该探针由商用试剂9,10-菲醌和4-(甲基巯基)苯甲醛通过一步反应生成，只需简单过滤水洗即可得到大量纯净的产品(产率达85%)。探针MPI以菲并咪唑为荧光基团，甲基苯基硫为识别基团。由于硫原子具有重原子效应[15]，探针荧光微弱。但在次氯酸存在下，探针分子内具有供电子性质的硫原子被氧化成具有拉电子性质的亚砜，重原子效应减弱，同时ICT效应加强，可在光激发下引起荧光增强信号。研究发现探针MPI对次氯酸检测时具有反应快(3 min)，灵敏度高和选择性好的特点。荧光成像实验表明该探针具有良好的生物相容性和和细胞渗透性，可用于活细胞内次氯酸的可视化检测。因此，本研究为机体内次氯酸的检测与追踪提供了一种简单且有效的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

1H NMR和13C NMR通过Bruker AVANCE-500M型核磁共振仪测得。ESI-HRMS 经Brucker APEX IV(7.0 T)FTMS型高分辨质谱仪测得。荧光光谱在RF-5301PC型荧光分光光度计(Shimazu Co.，Japan)上测定。细胞成像图在倒置荧光显微镜(NIKON Eclipse Ti-S，Japan)下获得。

9,10-菲醌、4-(甲基巯基)苯甲醛、醋酸铵和冰醋酸购于安耐吉化学有限公司。其他分析纯试剂购于国药集团上海化学试剂有限公司。所用去离子水(≥ 18 MΩ·cm)由Milli-Q纯化系统制备。

1.2 探针2-(4’-甲基硫基苯基)苯并咪唑(MPI)的合成与表征

向100 mL的圆底烧瓶中依次加入9,10-菲醌(208 mg,1.0 mmol)，4-(甲基巯基)苯甲醛(183 mg,1.2 mmol)，醋酸铵(305 mg,5.0 mmol)和冰醋酸(30 mL)，使混合液在120 ℃下反应5 h。将瓶中液体倒入冷水(30 mL)中，可观察到有白色沉淀物质产生。通过布氏漏斗过滤，收集滤渣，用去离子水淋洗3次，经烘箱干燥(55 ℃)后得纯净的灰色粉末MPI(288 mg,85%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ8.63-8.54(m，2H)，8.42-8.30(m，2H)，7.88(d，J=8.3 Hz，2H)，7.60-7.50(m，4H)，6.88(d，J=8.2 Hz，2H)，2.32(s，4H)。13C NMR(126 MHz，CDCl3)：δ148.42，141.22，131.30，130.03，128.41，127.00，126.35，125.68，125.48，125.21，123.78，123.60，121.82，14.94。MPI(C22H17N2S+)的理论相对分子质量为341.110 7，实测值为341.113 5。

1.3 光谱测试

用万分之一分析天平准确称取一定质量的探针MPI，以色谱纯的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配成1 mmol/L的储备液。活性氮及活性氧物种等其他分析物的储备液(1 mmol/L)根据文献报道方法配制[16]。

样品溶液的配制：向25.00 mL容量瓶中加入0.25 mL的MPI储备液和适量体积的与生物相关的离子、活性氮及活性氧物种等分析物储备液(1 mmol/L)，配成待测物的PBS溶液(DMF>∶H2O=2>∶8，体积比，pH 7.4)。待样品溶液孵育3 min后，在荧光分光光度计上测试荧光光谱。采用385 nm的光辐射作为激发光，记录395～600 nm之间的发射光谱。

1.4 荧光成像

将HeLa细胞放置在细胞培养箱(37 ℃，含5% CO2)中，用含有100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素以及10%小牛胚胎血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基培养。在进行细胞成像实验之前，先将HeLa细胞转移至96孔板中生长24 h。取一部分上述细胞与探针MPI共孵育30 min，作为空白组；取另一部分细胞先与探针MPI共孵育30 min后，再与NaOCl(50 μmol/L)共孵育10 min，作为实验组。用温热的PBS缓冲溶液(37 ℃，pH 7.4)清洗细胞外残余的探针。最后，在倒置荧光显微镜下观察并记录两组细胞的图像。

2 结果与讨论

2.1 识别性能研究

为了证明探针识别次氯酸的能力，测试了MPI与次氯酸反应前后的紫外光谱和荧光光谱。从图1A可以看出，探针MPI的紫外光谱在330 nm和365 nm处有2个吸收峰。加入次氯酸后，330 nm处的紫外吸收消失，同时365 nm处的吸收变弱。图1B显示，探针MPI在385 nm光辐射下展现微弱的荧光信号，这主要是由于探针分子结构中硫原子的重原子效应所致。然而，在加入次氯酸后，探针在445 nm处的荧光发射明显增强。这些初步的实验结果表明探针可以在水溶液中通过荧光光谱法检测次氯酸。

2.2 检测机理

基于探针MPI与次氯酸作用前后的荧光变化，推测探针分子上的硫原子在次氯酸的氧化下转化为亚砜。为证实这一假设，以高分辨质谱对探针MPI进行表征。如图2A所示，探针在m/z=341.113 5处有1个强的分子离子峰。探针与次氯酸反应后溶液的高分辨质谱图见图2B，反应混合物在m/z=357.105 4处有1个很强的分子离子峰，其质荷比与探针MPI不同，与化合物2-(4’-甲基亚砜基苯基)苯并咪唑(SPI)的相对分子质量(m/z=357.105 6)一致，这表明探针上的硫原子确实被次氯酸氧化成亚砜。根据荧光光谱和高分辨质谱的结果，提出如下机理：荧光基团菲并咪唑由于硫原子的重原子效应导致荧光较弱；当硫原子被次氯酸氧化成亚砜后，重原子效应减弱，同时荧光分子ICT效应增强，在光激发下产生荧光增强信号(图3)。因此，利用次氯酸和探针之间的氧化还原反应可以实现次氯酸浓度-荧光强度之间的信号转换，达到荧光检测次氯酸的目的。

图3 MPI探针检测次氯酸的机理示意图Fig.3 Proposed sensing mechanism of MPI with HClO

图4 MPI荧光强度随时间的变化关系图Fig.4 Time-course fluorescence response of MPI(10 μmol/L) towards HOCl in PBS buffer(DMF>∶H2O=2>∶8,by volume,pH 7.4)

2.3 响应时间与选择性

为了探究探针与次氯酸反应的动力学，考察了探针MPI与次氯酸混合后荧光强度随时间的变化情况。从图4可以看出，反应体系荧光随着时间的延长而逐渐增强，3 min后达到饱和，因此，选择3 min作为探针与次氯酸的反应时间。

2.4 灵敏性

为了考察探针对次氯酸检测的灵敏性，测试了MPI(10 μmol/L)与不同浓度的次氯酸(0～100 μmol/L)在PBS缓冲液(DMF>∶H2O=2>∶8，体积比，pH 7.4)中孵育3 min后的荧光光谱，发现探针的发射光谱强度随着次氯酸浓度的增加而上升。通过数据拟合，发现探针在445 nm处的荧光强度(Y)与次氯酸的浓度(X，0～100 μmol/L)呈现良好的线性关系，线性方程为Y=2.329 5X+32.122 9，线性系数为0.997 7。根据检出限计算公式(LOD=3σ/k，σ为空白样品连续测定11次的标准偏差，k为标准曲线斜率)[17]，得到方法检出限为0.26 μmol/L。相比文献报道的次氯酸探针(表1)，MPI具有较低的检出限。上述结果说明MPI可以高灵敏、定量检测次氯酸。

表1 检测HClO/ClO-荧光探针的比较Table 1 Comparison of fluorescence probes for detection of HClO/ClO-

2.5 细胞成像

基于探针优异的识别性能(响应快(3 min)，适用于生理pH值(7.4)，高的灵敏性和选择性)，利用MPI对细胞内的次氯酸进行荧光成像，结果如图6所示。当HeLa细胞与探针MPI共孵育30 min后，细胞内部无荧光信号(图6B)。然而，将预处理的HeLa细胞与次氯酸共孵育10 min后，可以观察到明亮的蓝色荧光(图6D)。从明场成像图可知，细胞生长正常，表明MPI具有较好的生物相容性。上述实验证明当前探针具有良好的细胞膜通透性，适合于细胞内次氯酸的成像分析。

图6 HeLa细胞与MPI共孵育30 min(A,B)和经MPI处理的HeLa细胞与次氯酸共孵育10 min(C,D)后的明场图以及荧光图Fig.6 Bright field images and fluorescence images of HeLa cells incubated with MPI(10 μmol/L) for 30 min(A,B) and MPI pretreated HeLa cells and again treated with HClO(50 μmol/L) for 10 min(C,D) bright field image:A,C;fluorescence image:B,D

3 结 论

本研究以菲并咪唑为荧光团，甲基苯基硫为识别位点，通过简单一步反应成功得到一种荧光增强型的次氯酸荧光探针MPI。该探针简单易得，无需复杂的纯化过程。分析结果表明探针MPI对次氯酸的荧光分析具有响应快速(3 min)，选择性高和检出限低(0.26 μmol/L)的特征。更重要的是，探针MPI具有良好的细胞相容性，在HeLa活细胞中实现了次氯酸的可视化荧光成像。因此，本研究为深入研究生物体内次氯酸的功能与作用提供了一种简单且有效的工具。