胜红蓟上一种与双生病毒伴随的重组β卫星分子的鉴定

孙少双　王冬雪　杨秀玲　周雪平

摘要 双生病毒是一类在全球范围内危害嚴重的单链环状DNA病毒。本研究从2017年采自云南的胜红蓟样品中（YN2017）获得了一条菜豆金色花叶病毒属病毒和一条β卫星的全基因组序列。该双生病毒的全长序列与烟草曲茎病毒的相似性最高，为99.60%，确定为烟草曲茎病毒的分离物。YN2017 β卫星与中国胜红蓟黄脉β卫星的同源性最高，为90.8%。进一步分析发现，该β卫星的卫星保守区域（SCR）至富含腺嘌呤区（A-rich区）之间约1 kb的序列与中国胜红蓟黄脉β卫星相应序列的相似性高达97.2%;其包含的A-rich区上游与SCR之间约300 bp的序列与中国胜红蓟黄脉β卫星相应序列的相似性仅为70.2%，而与烟草曲茎β卫星相应序列的相似性最高，为97.3%。重组分析发现，所分离的β卫星是由中国胜红蓟黄脉β卫星和烟草曲茎β卫星重组产生。这是首次在中国发现由不同的β卫星重组产生的β卫星分子。

关键词 胜红蓟; 双生病毒; β卫星; 重组

中图分类号：

S 432.41

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019253

Identification of a recombinant geminivirus-associated betasatellite from Ageratum conyzoides

SUN Shaoshuang， WANG Dongxue， YANG Xiuling*， ZHOU Xueping

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Geminiviruses are a group of single-stranded DNA viruses that cause severe losses to many crops worldwide. In this study， we determined the complete nucleotide sequences of a begomovirus and a betasatellite from an Ageratum conyzoides plant （YN2017） showing yellow vein and leaf curling symptoms in Yunnan. The begomovirus shared 99.60% sequence identity with Tobacco curly shoot virus （TbCSV）and thus was identified as an isolate of TbCSV. The YN2017 betasatellite shared the highest sequence identity （90.8%） with Ageratum yellow vein China betasatellite （AYVCNB）. Further analysis of the betasatellite sequences showed that the sequences from the satellite conserved region （SCR） to the A-rich region shared 97.2%identity with the homologous sequences of AYVCNB， while the sequences between the SCR and the upstream A-rich region only shared 70.2%identity with that of AYVCNB. Instead， these sequences were more closely related （97.3%sequence identity） to the coordinated sequences of TbCSB. Recombination detection analysis showed that the betasatellite might result from the recombination of AYVCNB and TbCSB. This is the first report of a recombinant betasatellite that has arisen from betasatellites recombination in China.

Key words

Ageratum conyzoides; geminivirus; betasatellite; recombination

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒，病毒粒子大小为18 nm×30 nm。基于基因组结构、介体种类和寄主范围，2017年国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV）将双生病毒科分为9个属和2个暂定种，分别为玉米线条病毒属Mastrevirus、菜豆金色花叶病毒属Begomovirus、甜菜曲顶病毒属Curtovirus、番茄伪曲顶病毒属Topocuvirus、美杜莎潜隐病毒属Capulavirus、画眉草条纹病毒属Eragrovirus、伊朗甜菜曲顶病毒属Becurtovirus、芜菁曲顶病毒属Turncurtovirus和葡萄红色斑点病毒属Grablovirus以及桑花叶型矮缩相关病毒和柑橘褪绿矮缩病毒[1]。其中，种类最多、造成危害最严重的是由烟粉虱以持久性方式传播的菜豆金色花叶病毒属病毒。

菜豆金色花叶病毒属病毒的基因组既有单组分，也有双组分。其中，双组分双生病毒的基因组含有大小约为2.5～2.6 kb的DNA-A和DNA-B两个组分，单组分的双生病毒仅含有一个在大小和结构上与双组分病毒的DNA-A组分类似的DNA组分[2]。很多单组分的双生病毒都伴随有一类卫星DNA分子，大小约为1.3 kb，称为β卫星（betasatellite）。虽然β卫星依赖辅助病毒进行复制、转录和装配，但是β卫星是一个多功能的DNA分子，能够逃脱RNA沉默等植物防御反应，并且是胜红蓟黄脉病毒Ageratum yellow vein virus（AYVV）、木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus等多种菜豆金色花叶病毒诱导产生典型的病害症状所必需的[3-5]。自1999年从感染AYVV的胜红蓟样品中首次分离鉴定出β卫星以来[6]，目前已鉴定的β卫星的全长序列多达1 300多条。由于β卫星的种类较多，2017年ICTV将其划分为番茄曲叶病毒卫星科Tolecusatellitidae β卫星属Betasatellite，包含了61个种（http：∥talk.ictvonline.org/taxonomy）。β卫星与其辅助病毒组成的病害复合体广泛分布于全球37个国家和地区，对棉花、番茄、番木瓜等多种作物造成了毁灭性危害[4]。

杂草因其分布广泛、生存能力强，是多种双生病毒的中间寄主和初侵染源，在双生病毒的病害流行中具有重要作用[7-8]。胜红蓟Ageratum conyzoides L.，又称白华草，为菊科藿香蓟属一年生草本植物，主要分布在我国福建、云南、广东和贵州等地，具有清热解毒、止血止痛的功效。目前已有报道发现胜红蓟是多种双生病毒，如AYVV、中国胜红蓟黄脉病毒Ageratum yellow vein China virus、烟草曲茎病毒Tobacco curly shoot virus（TbCSV）和番木瓜曲叶病毒Papaya leaf curl virus的寄主[6， 9-12]。本研究从云南采集了表现曲叶和黄脉症状的胜红蓟样品，从中分离到了TbCSV，并首次从中国分离到由不同的β卫星重组产生的β卫星分子。

1 材料与方法

1.1 病害样品的采集

2017年8月从云南省采集了胜红蓟病株（YN2017），该病株具有明显的黄脉和叶片卷曲等疑似双生病毒侵染的症状（图1）。

1.2 植物总DNA的提取及PCR检测

利用CTAB法提取胜红蓟病株YN2017的叶片总DNA[13]。以提取的总DNA为模板，利用双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒的简并引物PA/PB（PA： 5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′;PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′）进行PCR检测。该引物扩增的目的片段约500 bp，扩增区域包含该属病毒的基因间隔区及外壳蛋白保守区。同时，利用β卫星的通用引物β01/β02（β01：5′-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3′;β02：5′-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3′）扩增双生病毒β卫星的全长序列（约1.3 kb）。PCR反应体系为：2×TransStart FastPfu DNA Polymerase mix（北京全式金生物公司） 10 μL、20 μmol/L的上、下游引物各0.2 μL、植物总DNA 200 ng，加超纯水补齐至20 μL。扩增条件：95℃预变性2 min;95℃变性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s（PA/PB引物）或1 min（β01/β02引物），循环35次;72℃延伸10 min。PCR反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。在紫外灯下割取目的片段，利用Omega DNA凝胶回收试剂盒分离纯化目的片段，将回收产物与pEASY-blunt cloning vector（全式金生物公司）連接，通过热激法转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，涂布于含有卡那霉素的LB固体平板上，在37℃条件下倒置培养过夜，菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆送至擎科生物测序公司测序。

1.3 病毒DNA-A全长基因组的克隆

在测序获得的500 bp片段的DNA-A序列基础上，设计扩增病毒DNA-A全长的特异引物（A-F：5′-GTCGAAGCGTCCAGCAGATA-3′;A-R：5′-AGCGGGCGTGGAAATGATTA-3′）对胜红蓟样品中的DNA-A全长进行扩增，PCR反应体系参考1.2，PCR扩增条件为：95℃预变性2 min;95℃变性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸2 min，循环35次;72℃延伸10 min。按1.2中的方法进行克隆测序。

1.4 病毒DNA-A及其β卫星的基因组结构和进化重组分析

利用DNASTAR Lasergene 7软件中的EditSeq和SeqMan对所测定的DNA-A和β卫星的序列进行处理和全长拼接;利用NCBI中的BLAST进行比对分析，寻找同源关系较近的序列;用SnapGene软件构建β卫星的基因组结构;利用MEGA 7.0软件的邻近相连法（neighbor-joining method）构建系统进化树，步差值设置为1 000;利用RDP 4.97软件对序列进行重组分析，参数设置为：读宽30 nts，置信概率0.000 1，所测重组序列之间需要有50%～100%的序列相似性[14]。

1.5 重组β卫星亲本序列的检测

以YN2017样品中的DNA为模板，分别采用AYVCNB的特异引物（AYVCNVB-F：5′-CCATCTCATATTTACGAAGTC-3′;AYVCNVB-R：5′-GCCCACCTCCGTGTTGGTACT-3′），以及TbCSB的特异引物（TbCSB-F：5′-GTCTACACAGTACTACGTTGA-3′;TbCSB-R：5′-ACCCTCCCAGGGGTACACAAC-3′）进行PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 病毒DNA-A的基因组扩增及结构分析

以胜红蓟病株YN2017的总DNA为模板，利用引物PA/PB从样品中可以扩增得到约500 bp的目的片段。将测序得到的序列在NCBI上进行BLAST分析，结果发现，克隆的片段与TbCSV的外壳蛋白的相似性高达99%，表明该样品可能感染了双生病毒。进一步根据测序得到的序列设计扩增病毒全长的特异引物A-F和A-R，从胜红蓟样品中扩增得到大约2.8 kb的特异片段。将目的片段克隆测序，并且进行序列拼接后得到的DNA-A全长序列为2 746 bp（GenBank登录号：MK948360）。序列分析发现，所获得的DNA-A具有菜豆金色花叶病毒属病毒典型的基因组结构，共编码了6个开放阅读框（open reading frames， ORFs），其中病毒链编码了AV1（294-1 064 nt）和AV2（134-481 nt），互补链编码了AC1（1 513-2 598 nt）、AC2（1 206-1 610 nt）、AC3（1 061-1 465 nt）和AC4（2 148-2 570 nt），AC1和AV2之间含有一个283 nt的基因间隔区（intergenic region， IR）。IR区中具有一个茎环结构，包含了病毒复制和转录起始所需的9碱基保守序列TAATATTAC。

2.2 病毒DNA-A的进化和重组分析

利用NCBI的BLAST将YN2017分离物DNA-A的全长基因组序列与GenBank数据库中的序列进行比较，发现其与TbCSV-[Y282]（AJ971266.1）的全长序列相似性最高，为99.60%。利用MEGA 7.0软件构建系统进化树，发现TbCSV-[YN2017]与TbCSV的云南分离物TbCSV-[Y282]（AJ971266.1）和TbCSV-[Y35]（AJ420318.1）的亲缘关系最近（图2）。根据ICTV制定的双生病毒种的分类标准，TbCSV-[YN2017]为TbCSV的一个分离物。RDP重组分析表明，TbCSV-[YN2017]并无重组事件发生。

2.3 β卫星的基因组扩增及结构分析

很多单组分的菜豆金色花叶病毒都伴随有β卫星分子，β卫星与其辅助病毒形成的病害复合体给农作物生产造成了巨大危害。前期研究表明，有些TbCSV的分离物伴随有β卫星，有些分离物不含有β卫星分子[15]。为了明确采集的YN2017样品中是否伴随有β卫星分子，利用双生病毒β卫星的通用引物β01/β02从样品中扩增得到了约1.3 kb左右的目的片段。将片段回收后进行克隆测序，序列拼接后得到1 335 bp的全长序列（GenBank登录号：MK948361）。对其基因组结构进行分析，发现该β卫星具有典型的β卫星的结构，主要包括三个特征：1） 含有一个大小约120 bp的卫星保守区（satellite conserved region， SCR）。SCR区含有保守的茎环结构和9碱基核苷酸序列TAATATTAC;2） 互补链上编码一个大小约为13 kD的βC1蛋白;3） βC1上游还含有一个腺嘌呤富含区（A-rich region），表明YN2017分离物伴随有β卫星分子。

2.4 β卫星的进化和重组分析

利用BLAST对YN2017样品中的β卫星的全长基因组序列与GenBank数据库中的序列进行比对，发现该β卫星与中国胜红蓟黄脉β卫星Ageratum yellow vein China betasatellite（AYVCNB）海南分离物AYVCNB-[Hn9]（AM048835.1）和AYVCNB-[Hn2]（AM048834.1）的相似性最高，均为90.8%。进一步分析发现，YN2017 β卫星的1-979 nt和1 282-1 335 nt的序列与AYVCNB-[Hn9]相应序列的相似性高达97.2%;980-1 281 nt的序列与AYVCNB-[Hn9]相应序列的相似性仅为70.2%，而与烟草曲茎β卫星TbCSB-[Y35]（AJ421484.1）相应序列的相似性高达97.3%，暗示着YN2017 β卫星可能是由重组产生的。利用RDP软件进行分析，发现YN2017 β卫星是由AYVCNB和TbCSB重组产生的一个β卫星分子，AYVCNB为主要亲本，TbCSB为次要亲本，重组的位点主要包括A-rich上游以及SCR之间的区域，重组的置信概率为2.676×10-33（图3）。基于β卫星的全基因组序列构建了系统进化树，发现YN2017样品中的β卫星在进化树上单独聚为一支（图4）。

为了明确YN2017样品中是否存在重组β卫星的亲本，结合YN2017 β卫星、AYVCNB和TbCSB的序列设计了检測AYVCNB和TbCSB的特异引物。结果发现，利用AYVCNB-F和AYVCNB-R以及TbCSB-F和TbCSB-R均检测不到目的条带，但是利用AYVCNB-F和TbCSB-R能够检测到约1.3 kb的条带，回收该片段并且进行克隆测序后，发现AYVCNB-F和TbCSB-R所扩增的条带确实为重组的β卫星分子。

3 结论与讨论

近年来，双生病毒在全国范围内的危害日益严重，给作物生产造成了严重威胁[16]。杂草是双生病毒重要的原始寄主或中间寄主，在双生病毒的侵染循环和病毒的暴发流行中具有重要作用。我们于2017年8月从云南采集了一份疑似感染双生病毒的胜红蓟样品，染病的胜红蓟叶片出现叶脉黄化、曲叶等症状。通过分子克隆以及序列分析，我们发现该样品中病毒DNA-A的全长序列与TbCSV-[SC118]的相似性最高，为TbCSV的一个分离物。我们还发现该样品中伴随有β卫星，且该β卫星是由AYVCNB和TbCSB重组产生。这是在我国首次发现双生病毒不同的β卫星之间可以发生重组产生新的β卫星分子。

Li等[15]對采自云南的番茄样品的病原进行检测，发现与TbCSV伴随的卫星为TbSCB。Jiao等[12]对2010年采自云南的胜红蓟样品的病原进行检测，发现侵染云南胜红蓟的病毒是TbCSV，伴随的卫星为AYVCNB。由于所鉴定的YN2017 β卫星是由AYVCNB和TbCSB重组产生，我们利用AYVCNB和TbCSB的特异引物去检测所采集的YN2017样品中是否存在重组β卫星的亲本序列，结果均检测不到AYVCNB和TbCSB;而将AYVCNB和TbCSB的特异引物进行交叉组合时能检测到重组β卫星。双生病毒除了以滚环扩增的方式在寄主植物的细胞核中进行复制外，还能够以依赖于重组的方式进行复制。我们推测可能是由于AYVCNB和TbCSB的复合侵染增加了病毒基因组重组的概率，导致了重组β卫星分子的产生。由于双生病毒对β卫星的复制具有复制选择性[17-19]，在长期的进化过程中TbCSV可能更倾向于复制和维持重组的β卫星。

重组是驱动双生病毒种群间遗传多样性和形成新种群的重要机制。重组产生的新病毒或株系往往具有更强的致病性，导致新的病毒或株系的形成，引起病毒病的大流行。其中一个典型的例子就是非洲木薯花叶病毒African cassava mosaic virus （ACMV）和东非木薯花叶病毒East African cassava mosaic virus（EACMV）重组后产生新病毒株系EACMV-[UgV]，重组病毒与ACMV复合侵染引起乌干达木薯花叶病的大流行，导致该国木薯毁灭性死亡[20]。目前已有多项研究表明，双生病毒的重组经常发生在同科不同属的病毒之间，也可以发生在同属不同种的病毒之间，或者发生在β卫星和辅助病毒之间，但是关于不同β卫星重组产生的β卫星的报道较少。2009年Mubin等[21]从巴基斯坦的棉花产区表现黄脉和曲叶症状的单年生杂草中首次鉴定到一种由不同的β卫星重组产生的重组β卫星，发现该重组β卫星是由烟草曲叶β卫星和木尔坦棉花曲叶β卫星重组产生;而我们的研究也是从杂草中鉴定到重组β卫星，表明杂草不仅可以作为双生病毒的初侵染源或中间寄主，而且容易使双生病毒发生重组产生新的病毒种类。因此需进一步加强对杂草上的病毒开展系统调查和检测，并在双生病毒病的防治过程中及时彻底清除田间杂草。

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（責任编辑：田 喆）