产ESBLs肺炎克雷伯菌药敏性和耐药基因表型分析

邓明惠，候 轩，张 微，王 辉，辜依海

(西安交通大学医学院附属三二〇一医院检验科，陕西汉中 723000)

肺炎克雷伯菌是医院及社区获得性感染中临床分离的最常见病原菌之一[1-2]。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，临床分离的肺炎克雷伯菌耐药性也越来越强，肺炎克雷伯菌在人体和外界环境中具有较强的生存能力，这使其成为导致社区获得性感染的主要病原菌之一[3]。有研究表明，社区获得性肺炎克雷伯菌感染导致的病死率高于医院获得性肺炎克雷伯菌感染导致的病死率，且近年来社区获得性肺炎克雷伯菌感染患者数量及感染患者的基因类型逐渐增多，患病程度也越来越严重[4]，因此，社区获得性感染也逐渐受到临床医生的高度重视。本研究收集本院各临床科室感染患者送检的各类标本中分离培养的产超广谱-β内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌菌株，检测其耐药性及ESBLs的基因表型，比较社区获得性感染和医院获得性感染菌株之间的差异，指导临床医生合理使用抗菌药物，并预防耐药菌株的传播。

1 资料与方法

1.1菌株来源 共收集2016年1月至2018年6月95株本院临床科室送检标本中分离培养出的产ESBLs肺炎克雷伯菌。因留菌污染等原因，经再次鉴定后，剔除14株菌株，剩余81株产ESBLs肺炎克雷伯菌，其中来自痰液标本56株，血液标本17株，尿液标本4株，分泌物标本3株，脑脊液标本1株。根据患者入院时间将81株产ESBLs肺炎克雷伯菌分为社区获得性感染及医院获得性感染，即患者入院48 h之内采集标本进行培养，并且患者在3个月内未到过医疗机构就诊或服用抗菌药物则划分为社区获得性感染，反之则划分为医院获得性感染。

1.2方法

1.2.1菌种鉴定 革兰染色：用接种环取1滴生理盐水滴在玻片上，用接种针取MH琼脂平板上已分纯的新鲜菌落，在生理盐水中涂匀，放烘箱中，待烘干后经酒精灯外焰固定，再进行革兰染色。加结晶紫液染1 min，用清水冲去染液沥干；加碘液染1 min，清水冲洗后沥干；再加脱色液，轻轻摇动10～30 s，至无紫色脱落为止，清水冲洗后沥干；最后加入复染液，约30 s，清水冲洗后放入烘箱，烘干后镜检。

1.2.2留菌判读依据 肺炎克雷伯菌为革兰阴性、较短粗的杆菌，大小(0.5～0.8)μm×(1～2)μm，单独、成双或短链状排列。无芽孢，无鞭毛，患者标本直接涂片或在营养丰富培养基上可见菌体外有明显的荚膜，多数有菌毛。在初次分离培养基上可形成较大、凸起、灰白色、黏液菌落。菌落大而厚实、光亮、湿润，相邻近菌落易融合，以接种针蘸取时可拉出细丝，在中国蓝琼脂培养基或麦康凯培养基上能发酵乳糖，并产酸，形成黏液型较大的有色菌落。

1.2.3质控菌株 阴性质控菌株大肠埃希菌ATCC25922和阳性质控标准菌株肺炎克雷伯菌ATCC70060均购自陕西省临床检验中心。

1.2.4纸片扩散(K-B)法 对临床收集并鉴定为肺炎克雷伯菌的菌株采用K-B法进行药敏试验，所用药敏纸片包括氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、头孢西丁、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星、复方磺胺甲噁唑、替加环素、米诺环素、多黏菌素E 21种抗菌药物，均购自英国OXOID公司。耐药折点的判读及产ESBLs确认标准参照2013年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准进行。

1.2.5肺炎克雷伯菌产ESBLs确认试验 使用到的材料及工具包括配制好的MH琼脂平板、分纯的单克隆菌落、无菌镊子、无菌生理盐水、无菌棉签、抗菌药物药敏纸片。将细菌传种于MH琼脂平板上，并分区划线，放入35 ℃恒温培养箱孵育18～24 h，挑取单克隆菌株，并调制菌悬液至0.5麦氏浊度单位，用无菌棉签蘸取适量菌液均匀涂布于MH平板上，室温放置5 min后贴抗菌药物纸片。将头孢噻肟(30 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(30/10 μg)、头孢他啶(30 μg)、头孢他啶/克拉维酸(30/10 μg)药敏纸片贴于MH琼脂平板上，两纸片间距离为25 mm，然后将贴好的MH琼脂平板置于35 ℃恒温培养箱孵育过夜后判读结果。

1.2.6耐药基因的检测 细菌DNA模板的制备：从低温冰箱中取出保存菌株，用接种环传种到血琼脂培养基上，然后快速将菌株放回低温冰箱，避免菌株反复冻融。在EP管中先加入2 mL双蒸水，再刮取3～5个已培养18～24 h的新鲜菌落置于EP管中，用移液枪轻轻混匀，置于沸水中煮10 min，再放置于离心机中(4 ℃，12 000 r/min)离心2 min，上清液即为粗提DNA模板，用移液枪吸取上清液至无菌的EP管中，保存于-20 ℃冰箱备用。PCR扩增筛选的耐药基因包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV，所用引物序列及扩增片段长度见表1，引物均由西安擎科生物有限公司合成。

表1 PCR扩增所用引物序列、扩增片段长度

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，多组间比较采用χ2检验，多组间中的两组比较采用Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1生化鉴定 95株细菌中有81株鉴定为肺炎克雷伯菌，即三糖铁试验阳性，蛋白胨水试验阴性，枸橼酸试验阳性，尿素试验阳性，经API20E鉴定结果符合率为99.8%。

2.2肺炎克雷伯菌药敏试验结果 对鉴定为肺炎克雷伯菌的81株菌进行了21种抗菌药物的药敏检测，结果发现这些菌株表现出了较高的耐药性，见表2。对于氨苄西林耐药率高达98.8%；但是对含抑制剂药物耐药率却有了明显的下降，如阿莫西林/克拉维酸(39.5%)、氨苄西林/舒巴坦(63.0%)、哌拉西林/他唑巴坦(2.5%)；对第一、二、三代头孢菌素药物的敏感情况也不理想，头孢呋辛敏感率为11.1%，头孢噻肟敏感率为3.7%，头孢他啶也仅有33.3%，而对第四代头孢菌素头孢吡肟耐药率为21.0%；所有菌株均对美罗培南、亚胺培南表现为较敏感，没有出现对碳青霉烯类药物耐药的菌株；对多黏菌素E敏感率为100.0%，对替加环素敏感率为93.8%，是仅次于碳青霉烯类药物及多黏菌素E敏感性较好的药物，氨基糖苷类药物中，对庆大霉素出现了72.8%的耐药率，但是对阿米卡星的敏感性较好，达到了82.7%；对其他药物如环丙沙星、四环素、复方磺胺甲噁唑等均表现出了较高的耐药率。

表2 81株肺炎克雷伯菌药敏试验结果[n(%)]

2.3社区获得性感染与医院获得性感染菌株药敏试验结果比较 44株社区获得性感染菌株和37株医院获性感染菌株对抗菌药物的耐药率见表3。44株社区获得性感染菌株和37株医院获得性感染菌株的药敏结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 社区获得性感染与医院获得性感染菌株 药敏试验结果(%)

2.4产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因型 过PCR扩增测序的方法获得产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因型，扩增的基因型包括CTX-M-1、CTX-M-9、TEM、SHV，发现81株产ESBLs肺炎克雷伯菌均检出ESBLs基因，其中TEM基因型阳性41株(50.62%)，SHV基因型阳性79株(97.53%)，CTX-M阳性51株(62.96%)，CTX-M-1基因型阳性29株(35.80%)，CTX-M-9基因型阳性26株(32.10%)，4株同时CTX-M-1与CTX-M-9基因型阳性。除16株携带单独ESBLs基因外(社区获得性感染7株，医院获得性感染9株)，其余的菌株均包含两种以上ESBLs基因，有36株细菌同时携带两种耐药基因(44.44%)，有24株细菌携带3种以上耐药基因(29.63%)。根据测序及结果比对，TEM阳性菌株全部为TEM-1基因型，SHV基因型阳性为SHV1和SHV11型，CTX-M型菌株均产ESBLs。81株细菌中，SHV基因型的检出率最高，CTX-M+SHV基因型为60.49%，耐药基因检测结果见表4。

将37株医院获得性感染菌与44株社区获得性感染菌的耐药基因表型进行比较，社区获得性感染菌在TEM、SHV、CTX-M-9基因型中阳性株均多于医院获得性感染菌株。在耐药基因阳性株的比例上，CTX-M-9在社区获得性感染菌中的携带率高于医院获得性感染菌携带率，差异有统计学意义(P<0.05)，其他的ESBLs基因型，如CTX-M-1、SHV、TEM基因型差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表4 肺炎克雷伯菌的耐药基因型

表5 社区与医院获得性肺炎克雷伯菌感染菌耐药基因型比较(n)

3 讨 论

肺炎克雷伯菌已成为社区和医院获得性感染中的重要病原菌，多重耐药的产生和传播给临床治疗带来了很大的困难[5]，并且产ESBLs肺炎克雷伯菌可以经过传导和整合等方式将耐药质粒传递给其他细菌，导致耐药现象更加严重[6-7]。本研究对81株肺炎克雷伯菌进行了21种抗菌药物的药敏检测，结果发现青霉素类药物已不适合临床治疗肺炎克雷伯菌引起的感染，而β-内酰胺酶抑制剂对于抑制菌株耐药起到了明显的作用。肺炎克雷伯菌对庆大霉素出现了72.8%的耐药率，对其他药物如环丙沙星、四环素、复方磺胺甲噁唑等均表现了较高的耐药率。值得庆幸的是，在本地区，还没有出现耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，由此可见，美罗培南、亚胺培南、多黏菌素E、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦是目前本院治疗肺炎克雷伯菌感染的最有效药物[8]。

传统观念认为，社区获得性感染菌株在对抗菌药物的耐药率上应该低于医院获得性感染菌株，其原因主要为医院获得性感染菌株面临的抗菌药物选择压力要远远大于社区获得性感染菌株，也更容易进化成多重耐药菌[9]。但是本研究数据显示，社区获得性感染菌株除对阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、头孢西丁、环丙沙星、复方磺胺甲噁唑这5种抗菌药物的耐药率比医院获得性感染菌株耐药率低9.7%～20.3%外，两者对其他抗菌药物的耐药率均比较接近，甚至有个别药物如哌拉西林、头孢呋辛等社区获得性感染菌株耐药率还略高于医院获得性感染菌株。由此看来，社区获得性感染菌株很可能会和医院获得性感染菌株有传播上的交叉，所以并不能认为社区获得性感染菌株只在院外流行，同时，这些菌株获得外源耐药基因的能力并不差于医院获得性感染菌株，故造成社区获得性感染菌株表现出的高耐药性接近甚至超过了医院获得性感染菌株。

产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的感染也在世界各地广泛流行[10]。由于抗菌药物使用观念和策略差异及细菌对不同抗菌药物的选择性压力不同，ESBLs流行类型在不同的国家和不同地区也有所不同[11]。有报道显示，在北美及西欧地区主要流行TEM型 和SHV型，而在东欧地区、亚洲地区和南美地区多流行CTX-M 型[12-14]。同样，在我国的不同地区，报道的优势ESBLs基因型也不完全相同，广东地区主要以CTX-M型为主，而TEM 型则在山西地区较常见[15]。而本研究在对81株产ESBLs的菌株进行常见的ESBLs基因筛查时发现，无论是社区获得性感染菌株，还是医院获得性感染菌株，与以往研究报道不同的是SHV在本研究中的检出率最高，达到了97.53%，大大超过了季淑娟等[16]研究报道的检出率(13.24%)，同时携带CTX-M+SHV基因型菌株占60.49%。总之，本院ESBLs基因以CTX-M和SHV基因型为主。

随着抗菌药物的大量使用，产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株耐药性逐年上升，使临床医生在抗感染治疗中面临着很大的困难，临床微生物室人员应该在日常工作中，根据细菌培养结果，加强细菌耐药性的监测，及时准确地发出报告。同时，应加强多重耐药菌的检测和上报工作，并统计本院的病原菌及耐药情况，制订成册，并联合医院感染科加强对临床医师进行培训，让他们能够合理使用抗菌药物，并重视抗菌药物的使用和管理，医护人员在日常操作中，应该加强无菌观念，对于携带多重耐药菌株的住院患者，应注意消毒和隔离，以防止其耐药菌在院内及院外的传播和流行。在对抗菌药物耐药率较高的肺炎克雷伯菌中，ESBLs基因携带率更高，故在日常工作中，在监测细菌耐药性的同时，更应加强ESBLs基因的检测。

4 结 论

综上所述，在本地区无论是产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株的耐药率，还是ESBLs耐药基因的携带率，社区获得性感染菌与医院获得性感染菌均比较接近。