蛋氨酸脑啡肽抑制肿瘤的作用机制及应用前景

邓 雷，庞晓燕，窦 磊，田东立，张 颐

0 引言

根据2017年中国最新癌症数据显示[1]，我国每年新发癌症429万例，死亡281万例，癌症已经成为威胁我国人民健康的一大原因。目前，癌症治疗以手术为主，放化疗为辅。早期癌症手术治疗效果较好，而在晚期癌症中，手术治疗已经无法达到理想的效果，化疗成为必要的治疗方式之一。目前，部分化疗方案不良反应较大，单一药物化疗有时无法满足治疗需要，为了达到更好的治疗效果，临床常使用联合用药，后者的不良反应问题引起了广泛关注，因此，癌症患者需要一种更加安全有效的化疗方案。蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin，MENK)可以调节机体免疫系统，抑制肿瘤生长，且不良反应少，可以作为目前化疗方案的佐剂。

1 MENK概述

MENK又名甲硫氨酸脑啡肽，是一种人体自分泌阿片肽，最早在1975年被Hghes发现，其结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met。MENK广泛存在于人体的各个正常部位以及肿瘤组织中，脑组织最多，其次为肠组织。虽然分布广泛，但MENK在正常人体内含量很低，在血浆中含量仅为50～150 pg/ml，并且在组织和血浆中迅速代谢，通常分泌后在血浆内的持续时间为20 min甚至更短。MENK生理剂量下在体内发挥重要作用。在MENK的早期研究发现，MENK广泛存在于神经系统的各级水平和部位，因此，MENK被视为一种神经递质，有镇痛作用。随着免疫学研究的不断深入，研究显示，免疫细胞被抗原刺激后也可产生MENK，而且MENK可以促进或抑制某些细胞因子的合成与释放，说明MENK参与免疫调节[2]。此外，研究人员发现，MENK是一种强效的生长刺激因子，可以影响细胞增殖[3]，所以又称MENK为阿片生长因子(Opioid growth factor，OGF)。MENK在生理浓度下可对细胞的生长起直接迅速的作用，且无细胞毒性、依赖性、耐受性及撤药反应[4]。基于上述优点，MENK逐渐被应用于肿瘤的治疗以及免疫调节，并取得了一定的成果。

2 MENK受体

2.1 MENK受体的分类及定位 经典阿片受体可分为 μ、δ、κ 3种亚型[5]，在神经细胞、免疫细胞和上皮细胞广泛表达[6]。MENK与这些受体结合后，可以通过下调 cAMP-PKA信号通路的表达[7]、提高钙调蛋白的含量[5]、提高中性粒细胞内蛋白激酶 C (PKC)的含量[8]等起到免疫调节的作用。1989年Zagon等[9]发现了新受体“zeta”，该受体主要调控细胞的增殖，进一步的研究表明，其与其他经典阿片受体基本不同，后更名为OGFr。早期的研究表明，OGFr是核相关受体，在细胞质没有分布，并且在分子水平和蛋白质水平上与μ、δ、κ阿片受体几乎没有同源性[10-11]。阿片生长因子(OGF)-OGF受体(OGFr)轴也位于细胞的外层核膜[12]。

2.2 MENK受体的功能 中枢神经系统中μ、δ、κ 3种阿片受体均存在，可以介导痛觉传导、调节情绪和行为等功能，同时具有成瘾性。免疫系统中的阿片受体主要为δ、μ受体，广泛存在于免疫细胞中，通过与MENK结合调节免疫功能[13]。Zagon等[9]应用免疫细胞化学技术等发现，OGFr在多种肿瘤细胞及正常细胞中皆存在，可以调节细胞的增殖。

3 MENK抑制肿瘤的机制

MENK对肿瘤的抑制作用主要通过调节机体免疫系统以及对肿瘤细胞的直接抑制和杀伤实现。

3.1 MENK通过免疫系统抑制肿瘤的作用机制 免疫系统具有监视、清除体内异常细胞的功能。MENK对免疫系统具有双向调节作用，即高浓度时抑制免疫系统，低浓度时刺激免疫系统，促进免疫细胞的增殖[14-15]，增强其对肿瘤细胞的杀伤作用[16-17]，并且调节细胞因子的合成与释放[18-19]，这对肿瘤的抑制和杀伤意义重大。

3.2 MENK直接抑制与杀伤肿瘤细胞的机制 有研究显示，头颈部鳞癌(SCCHN)组织中，OGFr 蛋白比正常上皮少90%。OGFr 蛋白在乳腺癌中表达明显低于乳腺良性病变[20]。当施加 OGFr 特异性抗体、OGFr 拮抗剂或采用反义 OGFr RNA 干扰 OGF-OGFr 的相互作用时，肿瘤细胞倍增速度加快，细胞数量显著增加[21]。这进一步证明了MENK对细胞生长的抑制作用是通过与 OGFr 结合实现。目前认为，MENK可以抑制肿瘤细胞的周期，且主要将肿瘤细胞抑制在G0/G1期[22]，但这并非唯一途径。有研究表明，MENK可以抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长，且抑制率与细胞内钙离子浓度有关[23]。目前MENK对肿瘤的抑制机制尚未完全清楚，现对目前研究较多的肿瘤进行阐述。

3.2.1 MENK抑制黑色素瘤的作用机制 Wang等[24]研究发现，MENK可以抑制黑色素瘤的生长，阻滞黑色素瘤A375细胞G0～G1期的细胞周期进展，MENK处理后A375细胞中μ(MOR)、κ(KOR)、δ(DOR)的mRNA表达水平增加，且以δ和μ为主，故推测MENK抑制黑色素瘤的生长可能与增加的受体数量有关。此外，MENK还可以诱导A375细胞凋亡并抑制侵袭。生存素是细胞凋亡抑制剂(IAP)家族的成员，是黑色素瘤发病机制中的重要分子。MENK处理48 h后，生存素的表达为对照组的0.011倍，提示MENK可能通过抑制生存素的表达而诱导细胞凋亡。Wang等[25]随后通过小鼠体内实验证明，经MENK治疗的小鼠，肿瘤生长延缓，肿瘤小鼠的存活率显著提高。MENK不仅可以直接抑制黑色素瘤B16细胞的增殖和转移，还可以通过刺激淋巴细胞亚群和细胞因子分泌来间接杀伤B16细胞，如CD3+淋巴细胞、CD4+与CD8+T细胞，并且增加细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的合成和释放。经MENK治疗后的小鼠肿瘤组织病理学形态明显改变，肿瘤中细胞坏死增加，细胞明显缩小，并可见核固缩，核碎裂。由于MENK能抑制黑色素瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡，并且增强荷瘤小鼠的免疫功能，因此，MENK理论上可成为黑色素瘤患者联合化疗的辅助治疗，并且可以作为黑色素瘤患者的免疫调节剂。

3.2.2 MENK抑制胰腺癌的作用机制 MENK对胰腺癌分化的不同阶段均具有无差别的作用，如高分化细胞Capan-1和MIA PaCa-2细胞，中等分化程度细胞系BxPC-3，以及未分化的胰腺癌细胞系等，MENK均可明显抑制其增殖。Zagon等[26]通过将BxPC-3人胰腺癌细胞系移植到裸鼠体内，建立了皮下移植瘤模型，来研究MENK如何抑制肿瘤发生和增殖，结果发现，经过MENK治疗后的小鼠同对照组相比，肿瘤明显减小且生存率增加，并且发现治疗后的小鼠体内肿瘤细胞内的OGFr明显增加。最重要的是，62%的OGF处理的小鼠在所有注射100%盐水的小鼠具有可见肿瘤时没有出现肿瘤。当OGFR被沉默后，肿瘤增长加快，给予OGF后没有抑制作用，当分别沉默μ、δ、κ 3种受体后，对肿瘤细胞的生长无影响。这说明OGF-OGFr对胰腺癌形成和发展具有稳定的调节作用。研究发现，MENK可以通过胰腺癌细胞中的p21细胞周期抑制激酶途径抑制肿瘤细胞DNA合成，并主要将其抑制在G0/G1期，从而降低其增殖能力[27]。因此，MENK可以作为胰腺癌的主要治疗方法，并作为其他化疗的佐剂途径，现已进入临床试验。

3.2.3 MENK抑制肝癌的作用机制 手术、消融和肝移植是肝癌患者获得长期生存的唯一方法，但肝癌的预后极差，其死亡率接近发病率。目前，在被切除的肝脏肿瘤细胞中已发现OGFr。Avella等[28]对3种肝癌细胞系进行研究，发现MENK可以显著抑制肝癌细胞的增殖，且呈浓度时间依赖性，同时，通过免疫组化发现OGF和OGFr能够互相结合，并定位于肝癌细胞的细胞质与细胞核中。当使用阿片受体拮抗剂纳洛酮(NLX)后，MENK对细胞增殖的影响消失。沉默人肝癌细胞中的OGFr后，内源性和外源性OGF的抑制作用也被阻断，给予μ、δ、κ特异的受体激动剂后，未对细胞产生显著的抑制增殖作用，这说明肝癌细胞生长抑制特异性的内源性阿片样物质是MENK，且MENK对各种肝癌肿瘤的抑制作用具有普遍性。MENK对肝癌的抑制作用不是通过促进细胞凋亡来实现，以往的研究表明，OGF-OGFr复合物可以进入细胞核内，诱导2种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16和p21的上调，从而导致Rb磷酸化的抑制和细胞周期G1-S期的延迟[29]，在肝癌细胞中是否也存在这一机制需要深入研究。

3.2.4 MENK抑制胃癌的作用机制 胃癌是常见恶性肿瘤之一，主要通过手术进行治疗，晚期胃癌一般采用化疗的方法，但疗效差。唐佳运等[30]研究发现，经过MENK处理的胃癌细胞，其增殖能力受到抑制，且与MENK呈剂量依赖性和时间依赖性，通过流式细胞术发现，MENK抑制肿瘤增殖能力是通过诱导凋亡来实现。Wang等[31]通过体外实验及小鼠成瘤实验证实，MENK可以引起Ki67、cyclin D1、c-myc mRNA减少，通过Wnt/β-catenin信号通路，以浓度和时间依赖性的方式显著抑制人胃癌细胞SGC7901和HGC27的生长，减少细胞集落的数量，并阻止G0/G1期的细胞周期。此外，MENK可通过上调Bax、下调Bcl-2和survivin以及激活caspase-3和PARP诱导肿瘤细胞凋亡。此外，MENK上调了SGC7901和HGC27细胞中阿片受体(OGFr)的表达。SNK7901、HGC27细胞中MENK和OGFr之间的相互作用可能对MENK的抗肿瘤活性至关重要。Wang等[32]的另一项研究表明，MENK可能通过阻断OGFr/PI3K/AKT/mTOR信号通路而使肿瘤内的巨噬细胞从M1表型向M2表型转化，并诱导细胞凋亡。

3.2.5 MENK抑制卵巢癌的作用机制 卵巢癌是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因，尽管早期治疗的效果较好，但卵巢癌复发率高，复发后的患者仅能接受姑息治疗。Donahue等[33]通过卵巢癌腹膜内异种移植小鼠模型发现，每日用MENK或低剂量阿片受体抑制剂纳曲酮(LDN)处理的小鼠，肿瘤细胞内OGF-OGFr轴明显上调，暴露于MENK或LDN后，小鼠腹腔中肿瘤结节的数量肉眼可见的显著减少，并且这些肿瘤的累积重量被抑制。同时，Donahue指出，MENK和LDN抑制肿瘤的机制与诱导细胞凋亡无关，而与抑制肿瘤组织中DNA合成和血管生成的作用有关。以往的研究表明，OGF-OGFr轴存在于卵巢癌中，采用siRNA技术沉默OGFr，可观察到用OGFr siRNA处理的肿瘤细胞数量增加，表明卵巢癌细胞的增殖依赖于OGF-OGFr轴，此外，MENK可以通过上调p16/p21CKI途径来抑制细胞增殖，将肿瘤细胞抑制于G1/S期[34]。采用siRNA技术敲减p16和p21蛋白显示，p16和/或p21蛋白诱导在OGF的抑制中是必需的[35]。Fanning等[35]对比OGF和OGFr在正常人卵巢表面上皮(HOSE)细胞、良性卵巢囊肿和卵巢癌的手术标本中的表达，结果显示，与HOSE细胞相比，在卵巢囊肿中OGF、OGFr的蛋白水平分别降低29%和34%，在卵巢癌中分别降低58%和48%。同时通过建立SKOV-3人卵巢癌细胞过表达OGFr克隆系，与用OGF处理的野生型细胞相比，过表达OGFr的克隆系用外源OGF处理后细胞生长减少70%～85%。在进一步研究中，将过表达OGFr克隆系与野生型细胞系移植入小鼠体内，4～5 d后野生型肿瘤均可测出，而过表达的克隆系则无可测量的肿瘤，直到3周后也有无法成瘤的小鼠个体，说明内源性和外源性OGF均可抑制肿瘤的生长[36]，进一步表明OGF-OGFr内源性阿片系统可能与卵巢癌发生有关。

4 MENK联合其他药物对肿瘤的作用

单独使用MENK可以达到抑制肿瘤增殖的目的，通过与其他抗肿瘤药物合用可以增加肿瘤抑制率，并减轻抗肿瘤药物的不良反应，降低化疗药物对免疫系统的损害。孟静娟等[37]通过对肝癌小鼠使用MENK和注射用重组人干扰素γ(IFN-γ)，观察联合用药的抗肿瘤效应，结果表明，MENK+IFN-γ能够延长小鼠生命，并抑制肿瘤生长，效果优于其他单独用药组，且联合用药时不良反应未增多，而 IFN-γ单独应用不能延长小鼠生命。孟静娟等[38]还通过实验研究MENK和IL-2对小鼠移植性瘤的抑制作用，同样证明联合用药的效果好于单独用药。王大路等[39]研究证明，MENK和低剂量LDN都可抑制胰腺癌细胞增殖，并且均能促进体内CTL、NK和γδT细胞增殖，抑制Treg细胞的增殖，两者合用时具有协同作用。李岩等[40]证明，MENK以及MENK联合5-氟尿嘧啶均可抑制人肝癌HepG2细胞生长并诱导细胞凋亡，联合用药组抑制作用强于单独用药组。李彦博等[41]证明，MENK能显著提高神经母细胞瘤SH-SY5Y对阿奇霉素的敏感性，增强其对肿瘤细胞生长的抑制作用并促进肿瘤细胞凋亡。Smith等[42]证明，OGF可能防止卵巢癌治疗中单独使用紫杉醇或顺铂后出现的全身毒性和体重减轻，同时联用时可以增加化疗药物对肿瘤的抑制作用。结果表明，MENK联合用药进行免疫调节和治疗肿瘤的可行性，为肿瘤治疗提供了新的思路。但MENK与其他药物之间在体内具体的相互作用，以及作用机制等仍需要进一步研究

5 展望

MENK对肿瘤的抑制和杀伤范围广，研究表明，OGFr存在于多种肿瘤细胞内，理论上MENK对含有OGFr的肿瘤都起作用。MENK还可以显著恢复晚期癌症患者受损的免疫系统，单风平[43]对21例癌症化疗后住院患者进行MENK治疗发现，经过3周静脉注射MENK治疗，在治疗后6个月，患者平均的NK细胞、CD4细胞、CD3细胞、T细胞以及T+B+NK细胞的数量逐渐增高，免疫功能显著改善，说明MENK对癌症患者免疫系统，特别是免疫功能低下的患者免疫系统的恢复有显著作用。MENK与现有的化疗药物联合应用还可以加强药物的效果，提高生存率。目前MENK已经在临床取得了一定的进展，随着免疫学和分子生物学的不断深入研究，MENK作用机制的不断揭示，期待MENK成为临床治疗肿瘤疾病的有力药物。