氧化损伤对过敏性结膜炎发病的影响

刘常明，朱伟林，王巍

浦东新区人民医院眼科，上海 201299

过敏性结膜炎不仅仅表现为眼部瘙痒不适，还可能损害眼表功能和结构，给患者造成致盲的风险。印迹细胞学应用于眼表疾病的取材及诊断已有多年，近年来与多种技术相结合，印迹细胞学有了更广阔的应用前景，也为过敏性结膜炎的检查和诊断提供了新的方法。本研究将过氧化物酶免疫组化染色技术应用于印迹细胞标本，旨在探讨氧化损伤对过敏性结膜炎发病的影响。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选取2017年3月至2018年10月期间在浦东新区人民医院眼科就诊的过敏性结膜炎患者50例纳入观察组，正常对照志愿者50例纳入对照组。纳入标准：所有入组者均自愿作为受试对象，配合相关检查；过敏性结膜炎患者均有眼刺痒，流泪，畏光，黏液性分泌物等症状，伴有结膜充血，水肿、大量乳头、滤泡等体征[1]。排除标准：急性感染性角膜炎、结膜炎；长期配戴角膜接触镜者；已行角膜屈光矫正手术者。

1.2 方法

1.2.1 试剂 鼠抗人过氧化物酶单克隆抗体，羊抗鼠二抗及二氨基联苯胺(DAB)显色剂等主要试剂均购自上海复能生物技术有限公司。

1.2.2 标本采集 0.4%的奥布卡因滴右眼，表面麻醉1～2 min后，用镊子将醋酸纤维薄膜贴于距角膜缘2 mm处上方球结膜表面，5～10 s后撕下，标本标注编号，先置于液氮罐中，后放置于-80°C冰箱保存。

1.2.3 HE染色 观察组和对照组各随机选择10例标本做HE染色，观察醋酸纤维膜印取结膜上皮细胞数量，以确定能否满足过氧化物酶免疫染色需要。

1.2.4 过氧化物酶免疫染色及阳性细胞判定确定醋酸纤维膜印取结膜上皮细胞数量能够满足过氧化物酶免疫染色需要后，余下标本使用Leica BoND-MAX全自动免疫组化染色仪做过氧化物酶免疫染色检测。细胞胞浆呈棕黄色且染色强度高于背景非特异性染色判定为染色阳性细胞。

1.2.5 镜检 光镜下统计过氧化物酶细胞染色阳性率。

1.3 统计学方法 应用SAS 9.2统计分析软件进行数据统计分析。计数资料比较采用χ2检验；计量资料经正态性检验均符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的HE染色情况 观察组和对照组标本HE染色提示醋酸纤维膜印取结膜上皮细胞数量丰富，均能够满足后续过氧化物酶免疫染色操作需要，见图1和图2。

图1 观察组标本HE染色(HE×400)

图2 对照组标本HE染色(HE×400)

2.2 两组行过氧化物酶免疫染色检测的受检者性别和年龄比较 两组行过氧化物酶免疫染色检测的受检者各40例，其中观察组男性19例，女性21例；对照组男性19例，女性21例，两组受检者的性别构成比比较差异无统计学意义(χ2=0，P＞0.05)；观察组患者的平均年龄为(41.60±17.47)岁，与对照组的(41.68±18.01)岁比较差异无统计学意义(t=0.02，P＞0.05)。

2.3 两组受检者的过氧化物酶染色结果比较 观察组患者的过氧化物酶细胞染色阳性率为(27.75±9.54)%，明显高于对照组的(5.00±3.92)%，差异有显著统计学意义(t=13.95，P＜0.01)，见图3和图4。

图3 对照组结膜细胞过氧化物酶染色(免疫组织化学染色×400)

图4 观察组患者过氧化物酶染色阳性细胞明显增多(免疫组织化学染色×400)

2.4 观察组患者不同性别和年龄的过氧化物酶细胞染色阳性率比较 观察组患者中男性过氧化物酶细胞染色阳性率为(25.52±10.26)%，与女性的(29.76±8.58)%比较差异无统计学意义(t=2.01，P＞0.05)；观察组患者中40岁以上过氧化物酶细胞染色阳性率为(25.29±9.43)%，与40岁及以下的(29.57±9.40)%比较差异无统计学意义(t=2.03，P＞0.05)。

3 讨论

过敏性结膜炎是临床常见的一种眼表疾病，发病率高，全球约20%的人有过敏性结膜炎病史[2]。过敏性结膜炎分为：季节性过敏性结膜炎、常年性过敏性结膜炎、春季角结膜炎、特应性角结膜炎、巨乳头性结膜炎。过敏性结膜炎的常见症状包括眼痒、眼干、异物感、烧灼感等，患者眼部奇痒难耐，症状反复发作，迁延不愈；过敏性结膜炎可以导致干眼的发生[3]，给患者造成明显不适；过敏性结膜炎损害眼表功能和结构[4]，部分类型可累及角膜，危害视力，激素的使用还可能升高眼内压，诱发青光眼，给患者造成致盲风险[5]；过敏性结膜炎患者常合并有过敏性鼻炎、支气管哮喘等全身疾病，严重影响患者的工作和生活。为了更有效的治疗这种常见的眼表疾病，研究其发生机制就尤为重要。

有研究表明，眼表在接触变应原后，与已致敏的结膜肥大细胞结合，肥大细胞脱颗粒，释放组胺、类胰蛋白酶、前列腺素、白三烯等递质，引起过敏性结膜炎的早期急性反应，主要特征是血管扩张，血管壁通透性增高，结膜充血水肿[6]。近年的研究提示，在早期急性反应6～8 h后进入变应性疾病的慢性阶段，氧化损伤和炎症反应很可能参与其中，主要特征是组织细胞产生大量活性氧产物，过氧化物酶表达增强，活性升高。过量的活性氧产物和氧自由基是引起氧化损伤的重要因素，氧化损伤能导致多种炎症介质释放和炎症细胞浸润[7-9]，诱导炎症反应，引起慢性无菌性炎症[10-12]。

有研究显示，在眼表变应性疾病的慢性阶段，结膜嗜中性粒细胞浸润，过氧化物酶水平明显升高[13]。过氧化物酶增高被认为是活性氧产物和氧自由基对机体组织产生氧化损伤的重要标志[14]。过氧化物酶免疫染色已广泛用于全身多系统疾病如甲状腺疾病[15]、肾病[16]、心血管病[17]、血液病[18]等疾病的诊断。染色原理是利用过氧化物酶标记抗体与抗原结合，使酶催化底物，将过氧化氢中的氧释放出来而产生新生态的氧，此新生态氧使无色的二氨基联苯胺氧化为蓝色的联苯胺，联苯胺是一种不稳定的中间产物，它可以进一步氧化变成棕色的化合物。过氧化物酶免疫染色产生有色产物，显示抗原所在的部位。胞浆内过氧化物酶含量不同，染色显示的棕色也出现深浅的不同。

植物花粉和污染的空气是常见的变应原[19]。植物花粉管在高活性过氧化物酶的促进作用下，得以生长发育[20]，当花粉与人体接触后，过氧化物酶会诱导黏膜细胞产生活性氧产物和氧自由基，氧化损伤导致白细胞介素等炎症介质的释放[21]，并且导致嗜中性粒细胞浸润[22]；污染的空气中也含有大量活性氧产物和氧自由基，容易对眼表细胞造成氧化损伤[23]。

尽管LEONARDI等[24]的研究显示过敏性结膜炎患者泪液中过氧化物酶活性显著增高，但是直接检测结膜上皮细胞中的过氧化物酶却鲜有报道。本研究是将过氧化物酶免疫染色技术应用于结膜印迹细胞学标本，观察过敏性结膜炎患者结膜上皮细胞过氧化物酶的表达及氧化损伤对过敏性结膜炎发病的影响。印迹细胞学作为一种快速方便易行、无创伤并可提供大量信息的眼表细胞学检查方法，多年来广泛用于眼表疾病的研究。近年来随着大量新技术如过氧化物酶免疫染色、电镜及流式细胞学等应用于印迹细胞学标本，印迹细胞学有了更广阔的应用前景。本研究结果显示过敏性结膜炎患者结膜上皮细胞过氧化物酶活性升高，表达增强，过敏性结膜炎组患者的过氧化物酶染色阳性细胞百分率明显高于对照组，两组过氧化物酶染色阳性细胞百分率差异有显著统计学意义(P＜0.01)。本研究结论说明氧化损伤对过敏性结膜炎的发生有显著影响，提示除了抗过敏、抗炎治疗外，抗氧化治疗可能是治疗过敏性结膜炎的一个新思路。SEO等[25]通过一项针对6～12岁少年儿童的研究显示，口服抗氧化剂如维生素C等可以减少变应性疾病的发生，这与本文的结论一致。过敏性结膜炎组不同性别、不同年龄组间过氧化物酶表达无显著差异，提示过敏性结膜炎是男女都可发病、并且终身都可能发生的一种疾病。本结论对研究过敏性结膜炎的发病机制，推进新技术在过敏性结膜炎诊断中的应用，探讨过敏性结膜炎的综合治疗等，均具有一定的临床意义。

志谢：本科研项目得到上海市浦东新区人民医院病理科王登山主任和医务部顾晓鸣主任的大力帮助。