奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定和耐药性分析

石玉祥，赵文鹏，刘 洋，刘 钢，杨 峰，高 健，韩 博

(1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193 ； 2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056038 ； 3.贵阳市动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550081)

奶牛乳房炎是奶牛常见多发的疾病之一，给奶牛养殖业带来巨大的经济损失。在引发奶牛乳房炎的病原菌中，革兰阴性菌(如大肠杆菌和克雷伯杆菌)和阳性菌(如金黄色葡萄球菌和链球菌)是主要的致病菌[1-2]。在导致奶牛乳房炎的革兰阴性菌中，大肠杆菌和克雷伯杆菌为最常见的致病菌[3-4]。肺炎克雷伯杆菌作为一种环境性致病菌，通常可在养牛场的垫料、污水、动物体表和粪便中分离到。奶牛肺炎克雷伯杆菌性乳房炎常发生在母牛泌乳期，此期发病的奶牛不但造成其产奶量降低和奶品质下降，而且严重时还造成急性死亡[5]。目前，针对肺炎克雷伯杆菌引发的奶牛乳房炎的主要治疗措施是抗生素疗法，但此疗法往往存在着预后不佳和反复发作的问题，且易造成肺炎克雷伯杆菌严重的耐药性。因此，深入研究奶牛乳房炎源性克雷伯杆菌的致病性和耐药性，为奶牛乳房炎的防治以及筛选和开发新型替抗产品提供策略。本试验对样品中肺炎克雷伯杆菌进行分离鉴定和耐药性检测，为研究奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯杆菌的生物学特性和致病性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2017年12月-2018年12月，在河北某大型奶牛养殖场无菌采集临床型奶牛乳房炎牛奶样品共计245份，用于肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定。肺炎克雷伯菌ATCC700603，购自温州康泰生物科技公司。

1.2 主要试剂 LB营养琼脂、LB肉汤、脑心浸液(BHI)和胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；脱脂绵羊血和革兰染色试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR Super Mix，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA Marker，购自北京华佰泰生物科技有限公司。

1.3 细菌的分离和纯化培养 将试验所需的灭菌棉签和TSA血平板于超净工作台中紫外照射20 min，用棉签蘸取适量的奶样在TSA血平板上划线接种，该平板记为P1板，37 ℃恒温培养箱中倒置培养18～24 h。取出 P1平板置于超净台，用灭菌的接种环挑取P1平板中单个菌落，利用四区划线法接种血平板，该平板记为P2板，37 ℃恒温培养箱中倒置培养18～24 h。

1.4 细菌的革兰染色镜检 参照革兰染色试剂盒说明书对细菌进行染色，并进行染色结果判定。根据染色后菌体的颜色将细菌分为2类：染色结果为蓝色的细菌通常为革兰阳性菌株，染色结果为红色的通常为革兰阴性菌株。

1.5 细菌的生化鉴定 对镜检结果为阴性的细菌进行触媒试验，若有产气反应(即H2O2液滴有气泡翻滚)，则记为触酶阳性，无反应者记为触酶阴性。挑取疑似菌株单菌落接种于生化管内，用封口膜将管口封闭，置于37 ℃恒温培养箱中培养16 h。根据肠杆菌科生化鉴定手册对试验结果进行比对判定。

1.6 细菌的DNA鉴定 将细菌过夜培养至平台生长期，吸取2 mL菌液，12 000 r/min离心3 min，弃去上清液获得细菌，参照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。设计合成引物，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，对疑似菌株16S rRNA 基因扩增，PCR产物进行凝胶电泳试验。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反应体系20 μL：1 μL DNA模板，上、下游引物(10 mol/L)各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL和ddH2O 7 μL，混匀之后瞬时离心。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s,72℃ 90 s，34个循环；72 ℃ 10 min，扩增结束后4 ℃保存。将获得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，待电泳结束后，通过Alpha Imager EC凝胶成像仪观察电泳凝胶，拍照记录结果。

1.7 纸片扩散法检测细菌的药物敏感性 将新鲜的菌液加到LB固体培养基上并涂均匀，待其干燥后，将药敏片贴在LB固体培养基上，每个培养基放置5个药敏片。置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h。用直尺测量抑菌圈的直径，记录数据，每种药物做3个平行试验。依照美国临床和实验室标准化研究所(CLSI) 2014版[6]执行标准判定结果：敏感(S)，中介(I)和耐药(R)。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯杆菌的菌落形态特征 分离获得的细菌在LB营养琼脂培养基上培养16 h，可见菌落呈现出圆润、光滑和表面凸起的形态(见中插彩版图1A)。经脱脂纤维绵羊血TSA培养基培养16 h，可观察到菌落形态呈现出大小2 mm左右、圆形且表面湿润的特征(见中插彩版图1B)，均符合肺炎克雷伯杆菌的菌落特征。革兰染色显示，该疑似菌株革兰染色呈红色，为革兰阴性菌，且该菌落形态为杆状或短棒状(见中插彩版图1 C1和C2)，符合肺炎克雷伯杆菌的形态特征。此外，对分离株进行触酶试验，结果均为触酶阳性，提示分离株为革兰阴性菌。

2.2 肺炎克雷伯杆菌的生化鉴定 将分离的细菌接种于肠杆菌科微量编码生化鉴定管中，37 ℃恒温培养16 h后，葡萄糖颜色由紫色变成白色，赖氨酸由暗红色变为浅紫色，鸟氨酸由棕色变为浅棕色，卫茅醇由紫色变为无色，尿素由黄色变为浅黄色且有气泡生成。疑似菌株在葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、卫茅醇和尿素生化管中均呈阳性；在硫化氢、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸橼酸盐生化管均呈阴性。通过将以上生化结果与肠杆菌科生化鉴定手册比对分析可知，该细菌的生化鉴定结果符合肺炎克雷伯杆菌的生化特征。

2.3 肺炎克雷伯杆菌的分子鉴定 提取细菌基因组DNA，经PCR扩增，将45株疑似菌株的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果显示，疑似菌株可扩增出大小一致的条带，且与目的条带大小相符合，约为1 500 bp，如图2所示，这与肺炎克雷伯杆菌的基因组大小一致。

图2 部分疑似肺炎克雷伯杆菌PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of suspected Klebsiella pneumoniaeM：DNA Marker； 1～16：部分离菌株的PCR产物条带； 17：肺炎克雷伯杆菌PCR产物条带M:DNA Marker; 1～16:PCR product band of partial isolates;17:PCR products of Klebsiella pneumoniae

2.4 肺炎克雷伯杆菌的耐药性检测 分离获得的肺炎克雷伯杆菌的药敏试验结果见表1。肺炎克雷伯杆菌对青霉素、四环素、庆大霉素和克林霉素的耐药率分别为73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，提示本次分离获得的肺炎克雷伯杆菌耐药性严重；对头孢氨苄、卡那霉素和头孢喹肟的敏感率分别为60%、46.7%和44.4%。

表1 肺炎克雷伯杆菌的耐药性分析Table 1 Drug resistance analysis of Klebsiella pneumoniae

3 讨论

通过细菌形态学观察、生化鉴定和PCR扩增试验确认分离菌株为肺炎克雷伯杆菌；药敏试验结果显示，肺炎克雷伯杆菌对青霉素、四环素、庆大霉素和克林霉素的耐药率分别为73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，对头孢氨苄、卡那霉素和头孢喹肟3种药物敏感。

奶牛乳房炎是由革兰阴性菌和革兰阳性菌感染乳腺上皮细胞引起的乳腺疾病。在临床型奶牛乳房炎中，由病原菌感染引发的乳房炎严重影响产奶量、乳品质以及增加治疗成本和死淘率，给乳制品行业造成重大经济损失[7]。肺炎克雷伯杆菌是一种常见的环境性致病菌，针对该菌引发的奶牛乳房炎通常采用抗生素进行治疗，长期使用抗生素导致病原菌耐药、药物残留和肉奶品质安全等问题日益突出[8-9]。本试验通过采集临床型乳房炎患病奶牛的乳样，对奶样中的肺炎克雷伯杆菌进行分离鉴定以及耐药性分析，为进一步研究奶牛乳房炎性肺炎克雷伯杆菌的致病性提供依据。

本试验分离获得的45株疑似肺炎克雷伯杆菌菌株在培养基上呈现出灰白色、黏液状、光滑、灰白色与粉红色交错、形态大小一致的菌落，这与张超等[10]报道的肺炎克雷伯杆菌的菌落形态特征相似。经革兰染色镜检观察，发现疑似菌株革兰染色为红色，表明该菌为革兰阴性菌，其形态呈现出单个、成双或短链状排列、短棒状或杆状的特征，这与Lin等[11]报道的肺炎克雷伯杆菌形态特征相符合。该疑似菌株的触酶试验结果显示均有气泡产生，这也进一步表明本试验分离的疑似菌株为革兰阴性菌。肺炎克雷伯杆菌属于肠杆菌科，具有独特的生物化学特性。生化结果显示，疑似菌株可分解葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、卫茅醇和尿素；对硫化氢、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸橼酸盐则不分解，与肠杆菌科生化鉴定手册比对分析可知，分离株生化鉴定结果符合肺炎克雷伯杆菌的生化特征，且这与林雅等[12]分离出的牛源肺炎克雷伯杆菌生化结果基本一致。随着分子生物学技术的发展，对病原菌的检测方法也从细菌的表型观察逐渐向病原菌的遗传生物学特征鉴定转变，一些敏感性高、特异性强的分子快速检测生物学技术(如PCR)在病原菌的检测中得到了广泛的应用。本试验的琼脂糖凝胶电泳结果显示，分离株DNA片段大小与目的菌株条带大小一致，提示所获得的45株分离株为肺炎克雷伯杆菌。通过分析总结以上结果可知，本试验分离所得的45株细菌为肺炎克雷伯杆菌，分离率为18.4%，表明河北地区奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯杆菌的流行率比较高。

抗生素在畜牧养殖业中得到了广泛应用，但由此造成的细菌耐药和药物残留等问题日益突出，也成为当今众多国家公共卫生安全领域最为严重的问题之一。近年来，肺炎克雷伯杆菌的耐药情况变的愈发严重，甚至出现多重耐药的现象[13-14]。本试验对分离所得的45株肺炎克雷伯杆菌进行药敏试验检测，发现肺炎克雷伯杆菌对青霉素的耐药达到70%以上，对四环素、克林霉素、氨苄西林和庆大霉素的耐药率在40%～55%，对头孢曲松、头孢噻肟和卡那霉素3种药物敏感，这与王乐等[15]的报道有区别。细菌耐药性的不同与获得病原菌的地域、季节和牛场管理模式以及牛场日常用药等有密切关系，而且同一种属细菌对相同药物的耐药性也存在一定差异。本试验结果表明，从临床型乳房炎患牛奶样中分离的肺炎克雷伯杆菌表现出严重的耐药性，说明了河北地区引起奶牛乳房炎的肺炎克雷伯杆菌的耐药性问题比较严重，寻求新型替抗产品治疗肺炎克雷伯杆菌引起的奶牛乳房炎迫在眉睫。

综上所述，本试验通过从细菌的菌落生长形态特征、生化特性和分子遗传学特征等方面对分离疑似菌株进行鉴定，确定分离45株细菌属于肺炎克雷伯杆菌，药敏试验结果表明，分离的肺炎克雷伯杆菌具有严重的耐药性，为河北省肺炎克雷伯杆菌引发的奶牛乳房炎防治提供科学理论依据。