哮喘患者外周血全基因组DNA甲基化检测及临床意义分析

张露露，王 炯

支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的呼吸道慢性疾病，其发病机制尚不明确，目前研究结果表明：复杂的基因与环境之间相互作用共同参与了哮喘的发病，可能是患者先后暴露于环境后表观遗传改变的结果，如DNA甲基化修饰、组蛋白共价修饰、miRNA改变、染色质改变等[1-2]，针对表观遗传学的治疗有可能为哮喘个体化精准治疗开辟新的途径。该研究对临床收集的哮喘急性发作期患者及健康对照者外周血全基因组DNA甲基化进行检测，并与下载的GSE56553数据库中的 96个基因芯片数据样本取交集，对差异基因功能通路进行生物学分析，探讨哮喘急性发作期患者与健康对照者之间DNA甲基化表观遗传学差异，以期筛选出哮喘发生发展过程中的关键基因和信号通路，为哮喘治疗提供新的靶点和策略。

1 材料与方法

1.1 实验对象与材料收集2018年8月～2019年9月经安徽医科大学第一附属医院老年呼吸与危重症医学科明确诊断为哮喘急性发作期的成人患者及同期健康体检者2 ml外周血标本各3份。患者知情同意, 自愿参与研究, 并签署知情同意书。GSE56553数据库为96例国人外周血标本Illumina DNA甲基化芯片检测数据集，其中正常人24例，哮喘急性发作期患者72例。

1.2 主要试剂与仪器PureLink Genomic DNA Mini KIT购自德国赛默飞世尔科技公司；基因芯片仪器：杂交炉、振荡器、Hyb Chambers 杂交盒、Hyb Chamber inserts均购自美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1主要实验步骤 本研究主要实验步骤依次如下：① 提取哮喘急性发作期及健康对照者外周血DNA；② 采用Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片，对提取的外周血DNA进行全基因组DNA甲基化状态检测，并与健康对照者甲基化谱进行比较，获得甲基化差异基因；③ 对筛选出来的哮喘患者外周血特异性甲基化基因进行GO/KEGG功能富集分析，以探讨差异性甲基化基因具体参与分子通路以及与哮喘发病的具体关系。

1.3.2外周血DNA甲基化芯片检测 本研究采用的甲基化特异性芯片为IllulIlina Human methlylation 450K Beadcllip全基因组甲基化芯片，提取外周血DNA后，重亚硫酸盐处理获得gDNA，处理后的gDNA和每种探针互补杂交，再利用芯片上的特异性捕获探针和互补的酶切基因片段结合之后，杂交过夜、清洗、延伸、染色、扫描获得原始数据。甲基化的程度根据两种探针的荧光强度判断。

1.4统计学处理原始数据标准化处理后，采用 Benjamini & Hochberg 方法进行多重检验纠正计算得到调整后的P值，根据调整后的P值筛选出差异的探针位点，根据探针水平计算甲基化差异程度(beta值)。下载GSE56553数据库中甲基化的数据。运用R语言包ChAMP对甲基化数据进行分析，使用内置的色彩校正和背景减法进行阵列归一化，并使用lumi包的分位数归一化函数进行默认设置，然后使用基于峰值的校正。差异甲基化的筛选标准为：P<0.05，筛选出1 493个差异甲基化基因。采用SPSS 17.0统计学软件包进行统计学处理。

2 结果

2.1 甲基化差异基因检测结果对哮喘急性发作期患者和健康对照者外周血全基因组DNA进行甲基化检测，发现病例组和对照组甲基化程度差异有统计学意义(见图1)，筛选出差异基因有1 493个，甲基化程度明显上调基因有923个，降低基因有570个，部分差异基因见表1。甲基化差异区域(DMRs)见表2。

2.2 GO/KEGG功能富集分析根据分析结果列表显示，共有422个差异甲基化基因的功能类别，包含了17 283个基因。其中生物过程和细胞组分部分含有的基因功能类别富集最多；从生物进程、通过细胞组分和分子功能方面对差异基因进行了全面的注释，差异基因主要富集通路和功能见图2。根据柱状图显示甲基化差异基因的集中在突触信号转导的调控、突触膜形成、化学突触传递的调节、肌肉收缩、无机分子实体跨膜转运蛋白活性等类别上。为进一步研究两组直接差异基因所参与的通路功能，进行了KEGG信号通路分析。筛选出富集程度最高的20条通路(见图3)，甲基化差异基因主要涉及磷脂酶D信号通路、钙离子信号通路、Rap通路、细胞黏附、细胞外基质相互作用等功能。结合GO和KEGG通路功能富集分析，提示哮喘发病是一个复杂过程，与各种信号通路激活相互作用有密切关联。

图1 哮喘患者和健康对照者外周血全基因组DNA甲基化位点热图

表1 哮喘患者与健康对照者部分甲基化差异基因

表2 哮喘患者和健康对照者差异甲基化主要涉及的区域

图2 GO通路分析结果

图3 KEGG通路分析结果

2.3 核心基因筛选通过STRING v11数据库对1 493 个差异基因进行基因相互作用的分析。限定研究物种为“Homo sapiens”，得到初始基因质互作关系，限定“minimum required interaction score”为0.5，进一步得到由726个差异基因参与的基因质互作关系，把726个差异基因及其间关联的“combined score”另外导入Cytoscape 软件中得到初始基因相互作用网络，用NetworkAnalyzer 对其进行分析，导出分析结果后用Microsoft Office Excel 2007 对Degree值按降序进行排序后，筛选出24个(Degree >20) 差异基因为核心基因。获得图4，通过构建差异基因的相互作用网络，我们可以得到网络中每个基因与其他基因的作用关系。Betweenness Centrality 表示基因在网络中的pathway中的枢纽评分，分值越高表示在网络中的枢纽位置更中心。Degree表示基因和其他基因关联的个数，如Degree=10代表与该基因有相互作用关系的基因有10个，Degree越大，代表与它有相互作用的基因越多。表3是基因的Degree和Betweenness Centrality，并按照Degree进行排序，获得24个关键基因。

图4 基因网络图

表3 关键基因

3 讨论

随着对分子遗传学的研究的深入，人们发现在DNA分子结构不变的情况下，一些修饰可以引起生物性状改变，这种改变具有遗传性称为表观遗传。表观遗传学即主要包含DNA甲基化、蛋白质的共价修饰、染色质重塑、非编码 RNA 调控等。DNA甲基化中最主要的修饰机制，主要影响基因表达和细胞分化发育方面[3]。哮喘是一种呼吸道慢性炎症性疾病，严重影响人类健康，近年来发病率逐渐升高[4]。对哮喘的表观遗传学研究，尤其是甲基化研究，逐渐成为哮喘发病机制研究[5-6]的新方向。本研究对外周血基因组DNA甲基化差异进行生物学分析，获得了差异基因1 493个，甲基化程度上调基因有923个，甲基化程度降低基因有570个，对比哮喘患者和健康对照者基因芯片结果进行分析，发现大部分促进哮喘发病的基因甲基化程度降低，如IL-1R1，ADM33等，而抑制哮喘发病的多数基因甲基化程度升高，如STAT3，IL-2等，说明基因甲基化水平的变化会造成基因表达谱的区别，抑制哮喘发病的基因表达降低而促进哮喘发病基因表达增加，进而导致机体内原有的平衡被打破，通过调节细胞代谢以及许多细胞因子诱导的免疫及炎症反应从而参与哮喘发生发展，也进一步表明[7]表观遗传学改变是参与哮喘发病的重要机制之一。

GO通路分析发现差异基因的功能主要集中在突触信号转导的调控、突触膜形成、化学突触传递的调节、肌肉收缩、无机分子实体跨膜转运蛋白活性等方面，说明神经通路激活及肌肉收缩与哮喘发病有密切关系[8]。KEGG通路分析显示甲基化差异基因主要涉及磷脂酶D信号通路、钙离子信号通路、Rap通路、细胞黏附、细胞外基质相互作用、PI3K-Akt信号通路等功能，提示哮喘的发生发展是多途径分子生物学信号通路共同作用所致。PI3K信号通路通过刺激支气管平滑肌细胞增殖，黏附分子诱导白细胞聚集进入气道，钙离子通道激活致使支气管平滑肌收缩等从而参与哮喘发病进程[9-10]。而磷脂酶D信号通路及Rap通路在哮喘中的作用机制尚未明确，是哮喘研究的新方向。

对1 493个差异基因进行基因相互作用进一步分析，按照基因相关度获得关键基因24个。TNF编码肿瘤坏死因子参与气道炎症发生发展，是判断支气管哮喘病情严重程度和治疗效果的重要指标之一；IL-10可以限制炎症反应以及自身免疫反应，在哮喘的发病机制调节中起到对哮喘有利的作用[11-12]。CREBBP基因编码的蛋白质CBP，参与气道重塑[13]。IGBT2和CD44分别编码CD18和CD44蛋白，是黏附分子中整合素家族的重要成员，其高表达会加重气道炎症，使气道的高反应性增加[14]。HDAC4和HDAC5属于组蛋白乙酰化酶家族，通过维持气道Th1细胞免疫应答、T细胞免疫应答平衡和抑制优势Th2细胞免疫应答中发挥重要作用，其活性与哮喘发生相关[15]。PRKCA表达蛋白激酶C-α促进平滑肌增生，激活嗜酸性粒细胞，参与哮喘发病[16]。GNB1、PIK3R1、PIK3R2、GNGT、CDC5L、DLG4、UBR4等基因在哮喘中的作用尚待探究，进一步深入研究将会为哮喘靶向治疗和早期诊断提供新的方向和策略。