AEBP1在胶质母细胞瘤中的表达及临床意义

茹晓宇，程传东, 计 颖

胶质瘤起源于脑神经胶质细胞，是成人中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，世界卫生组织将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅱ级的低级别胶质瘤和Ⅲ～Ⅳ的高级别胶质瘤，其中高级别胶质瘤占成人原发脑肿瘤75%[1]，胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)属于恶性程度极高的Ⅳ级胶质瘤，仅0.71%患者生存超过10年[2]，其致死率一直以来居中枢神经系统恶性肿瘤之首，中位生存期在15个月左右，预后差[3]。脂肪细胞增强结合蛋白1(adipocyte enhancer-binding protein 1，AEBP1)最初被认为是负性调节脂肪生成的转录抑制剂，是一新型炎症调控因子。越来越多研究发现AEBP1在肿瘤的发生发展中也发挥重要作用。如在胃癌、膀胱癌中AEBP1高表达且降低患者预后[4-6]。近期在结直肠癌组织中也发现AEBP1表达水平与肿瘤分期、转移、复发及预后相关，同时认为AEBP1可能成为具有化疗耐药性的结直肠癌患者的一种新治疗方法[7]。AEBP1在GBM中研究甚少，仅一篇2012年发表研究认为在胶质瘤细胞株中AEBP1基因抑制后，细胞增殖及存活能力受到影响，但AEBP1在GBM组织中表达水平、对患者预后等影响尚未有研究报道[8]。该研究拟通过对各类数据库综合挖掘，探究AEBP1在GBM中的表达水平及与各临床病理特征的相关性，分析对患者预后的影响，并对AEBP1在GBM中可能的功能和作用信号通路进行预测，以期从新的视角进一步阐明GBM发生发展过程中的可能机制，为寻求GBM治疗潜在的有效靶点，延长患者生存期提供依据。

1 材料与方法

1.1 Oncomine数据库分析Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/)是世界上目前最大的肿瘤基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，通过Oncomine数据库，可比较肿瘤组织和其正常组织中mRNA的差异表达。设定的主要筛选条件为：① 基因：AEBP1；② 分析类型：肿瘤vs正常组织；③ 肿瘤类型：中枢神经系统肿瘤；④ 数据类型：mRNA。以P≤0.05，差异倍数≥1.5，排名≥10%为阈值。

1.2 GEPIA网站分析GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)是由北京大学开发研究，整合TCGA、GTEx等数据库信息的可视化网站[9]。通过该网站设置|log2FC|截断值为1，P截断值为0.01，再次分析AEBP1 mRNA在GBM中表达水平，进一步利用该数据库生存分析功能探究AEBP1表达水平对GBM患者整体生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(disease free survival，DFS)的影响。分组截断值选择中位数。

1.3 TCGA分析从TCGA数据库(htps://www.cancer.gov/)中下载GBM患者的mRNA测序和临床信息数据，异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase，IDH1)基因突变信息从cBioPortal数据库下载。在R中使用edge R包对原始数据进行归一化处理及筛选在GBM中差异表达的基因，以|log2FC|>1且调整后P<0.05为筛选阈值。以AEBP1 mRNA表达水平的中位值为界，将GBM患者分为高表达和低表达组，分析AEBP1 mRNA表达水平与各临床病理特征相关性，最后行Cox比例风险回归分析，探究影响GBM患者生存的独立危险因素。

1.4 人类蛋白图谱分析人类蛋白质图谱(the human protein atlas，HPA) 主要是基于免疫组化分析的大型蛋白组数据库(https://www.proteinatlas.org/)，可提供约26 000种人蛋白质的在组织及细胞中的分布信息[10]。选择数据库中AEBP1抗体(CAB009966) 对正常大脑组织和胶质瘤组织免疫组化检测结果进行分析，共包括3例正常脑组织和 12例胶质瘤组织。

1.5 AEBP1及其共表达基因的GO和KEGG通路富集分析cBioPortal数据库(http://www.cbioportal.org)是一个开放的分析癌症基因数据的可视化工具，可进行多维度癌症基因集数据的探索。利用cBioPortal数据库Co-expression模块在“Glioblastoma TCGA cell 2013”数据集中找出与AEBP1共表达的817个基因(Spearmans相关系数绝对值≥0.4)。随后将AEBP1及其共表达817个基因上传至WebGestalt 网站(http://www.webgestalt.org/option.php)行GO与KEGG通路富集分析，WebGestalt网站是GO功能注释及KEGG通路富集分析一在线工具，更新及时，包涵较为全面的功能注释数据库。

1.6 统计学处理采用SPSS 24.0进行统计分析，Oncomine数据库和GEPIA网站分析中的两组间比较采用t检验。AEBP1表达水平对OS和DFS影响采用Kaplan-Meier(K-M)生存曲线进行分析，χ2检验或Fisher精确检验分析AEBP1表达水平与GBM各临床病理特征相关性，在R中利用Survival包行多因素Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AEBP1 mRNA在GBM组织中表达水平根据设定条件，共筛选出11项数据集，排除非GBM的数据集，最终纳入7项数据集包含AEBP1 mRNA在GBM中表达。结果7项数据集中均显示AEBP1 mRNA在GBM组织中高表达，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1A～G。进一步在GEPIA网站分析显示，GBM组(n=163)较正常组(n=207)高表达，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1H。

2.2 GEPIA网站分析AEBP1 mRNA表达水平对患者预后影响利用GEPIA网站绘制 K-M生存曲线显示，对162例GBM患者分析，AEBP1 mRNA高表达患者(n=81)OS低于低表达患者(n=81)，差异有统计学意义(P=3.9×10-5)，见图2A,且高表达患者有降低DFS趋势，但差异无统计学意义(P=0.086)(图2B)。

2.3 AEBP1 mRNA表达水平与临床各病理特征的相关性从TCGA 数据库中下载了588例GBM患者的mRNA测序数据，根据设置条件通过edge R包得到了236个差异表达基因，其中AEBP1是GBM患者中上调基因(log2 FC=2.813 076,P=4.75×10-5)。进一步筛选出同时有AEBP1 mRNA表达值和完整临床信息的病例总计160例，对AEBP1 mRNA表达与GBM各临床病理特征的相关性进行分析，结果表明AEBP1 mRNA表达在不同性别、年龄、种族、术后是否行放疗或化疗以及KPS评分高低组中均无统计学差异(均P>0.05)，但AEBP1 mRNA的表达与患者是否存在IDH1突变相关(P=0.005)，见表1。

2.4 AEBP1 mRNA表达水平是GBM患者的独立预后因素单因素分析发现AEBP1 mRNA的高表达(P=1.99×10-4)、术后未行放疗(P=4.5×10-7)、术后未行化疗(P=1.35×10-4)以及IDH1基因野生型(P=8.73×10-3)降低患者OS，差异均有统计学意义，年龄、性别、种族和KPS评分与患者预后无相关性(P>0.05)。随后将上述P<0.05的因素纳入多因素的Cox回归模型中行进一步分析，结果显示AEBP1 mRNA的高表达(HR=0.563 1(0.390 2，0.812 7)，P=2.16×10-3)和放疗(HR=3.925 5(1.559 6，9.880 6)，P=3.69×10-3)均是患者OS的独立影响因素，见表2。

2.5 AEBP1蛋白在胶质瘤组织中的表达水平为了进一步在蛋白水平证实AEBP1在胶质瘤组织中表达，在HPA数据库中IHC信息发现在3例正常脑组织神经胶质细胞中均未见表达，见图3A，12例胶质瘤中有4例显示AEBP1蛋白阳性表达，其中高级别胶质瘤阳性3例, 低级别胶质瘤阳性1例(图3B)。此结果进一步证实AEBP1蛋白在胶质瘤组织中阳性表达。

图1 AEBP1 mRNA在GBM患者中表达上调

图2 AEBP1 mRNA表达水平对GBM患者OS(A)和DFS(B)影响

2.6 AEBP1及其共表达基因的GO和KEGG通路富集分析对AEBP1及其共表达的817个基因进行GO功能富集分析，包括分子功能(molecular function，MF)，生物过程(biological process，BP)和细胞组成(cellular component，CC)三个部分。结果显示这些基因涉及的生物学过程主要为生物调节、代谢过程以及细胞增殖、繁殖、生长等；细胞组分分类中主要集中在细胞膜、细胞核等；涉及的分子功能主要包括蛋白质结合、离子结合、核酸结合转录因子活性等功能，见图4A。对AEBP1及其共表达的817个基因进行KEGG通路富集分析，以直方展示了富集的前10条通路，可见富集比最高的通路为Hippo信号通路，其次是NF-κB 、TNF信号通路等，见图4B。

图3 AEBP1蛋白在正常脑组织(A)和胶质瘤(B)中表达的IHC染色代表性图片

表1 GBM患者AEBP1表达水平与各临床参数的相关性(n)

3 讨论

GBM是中枢神经系统恶性肿瘤，标准的一线治疗方式主要为手术切除，缓解颅内高压和压迫引起症状，术后放疗同步联合替莫唑胺辅助化疗。有限的治疗手段目前不能满足临床治疗的需求，GBM的发生发展机制仍尚不清楚，故对关键肿瘤标志物的识别可助于胶质瘤的诊断及个性化治疗。本研究拟通过生物信息分析探究AEBP1在GBM患者中的表达及对预后等影响，并预测AEBP1发挥作用的可能机制。

Oncomine数据库筛选出的7项数据集均显示相对正常的脑组织，GBM组织中AEBP1 mRNA过表达，且基因差异倍数均大于1.5，其中liang数据集差异倍数高达10.017，进一步GEPIA网站分析再次证实AEBP1的高表达。该结果是基于Oncomine这一大型综合数据库和GEPIA网站分析所得结论，结果可信度高，对后续的研究验证具有重要的参考意义。利用HPA数据库进一步证实AEBP1蛋白在胶质瘤中阳性表达，且随着胶质瘤病理级别的提高，AEBP1的阳性率也随之提高，但所纳入样本量较少。下一步研究拟对大样本GBM患者组织行IHC染色，进一步研究AEBP1蛋白在GBM中表达及临床意义。

表2 影响GBM患者OS的单因素和多因素Cox回归分析

图4 AEBP1及其共表达基因的(A)GO(MF、BP、CC)和(B)KEGG通路富集分析直方图

GEPIA网站进行生存分析发现AEBP1 mRNA过表达降低GBM患者OS，其DFS也有降低的趋势。为进一步探究AEBP1 mRNA高表达在GBM中的临床意义，下载了TCGA数据库中160例GBM 患者AEBP1 mRNA表达值及对应临床资料，分析发现AEBP1 mRNA表达在不同性别、年龄、种族、术后是否行放疗或化疗以及KPS评分高低组中均未见统计学差异，但却发现与患者是否存在IDH1突变有统计学相关性。这一结论值得进一步深入探讨分析。随后行Cox生存回归分析，单因素分析发现AEBP1 mRNA的表达水平、术后是否行放疗或化疗以及IDH1基因突变与否影响患者OS，多因素分析显示AEBP1 mRNA表达水平及术后是否行放疗是独立的预后影响因素。这是目前首次报道AEBP1表达是GBM患者的独立预后因子。该结果提示AEBP1参与了GBM的疾病进展的过程，对于发现新的GBM标志物，验证疾病的相关机制和提出新的假设提供了新的机会。类似的，近期在结肠腺癌一项研究，单因素与多因素Cox回归分析也发现AEBP1高表达降低患者OS[11]。多项研究已证实IDH1突变可见于GBM，可明显改善患者预后, 是更有利生存结局的重要预测因子[12]。本研究单因素分析同样证实IDH1突变患者OS增加，但多因素未证实IDHI突变状态是GBM的独立预后因子，可能与本研究纳入Cox回归模型分析的因素有关。

本研究也对AEBP1在GBM中的功能及可能参与信号通路进行预测。通过GO功能注释发现AEBP1主要涉及生物调节、代谢过程以及肿瘤相关细胞增殖、繁殖、生长等生物学过程。KEGG通路富集分析排列前三位通路的分别是Hippo、NF-κB及TNF信号通路。其中NF-κB通路在GBM的重要作用近期发表在Cell上的一篇综述再次被强调[13]，AEBP1通过NF-κB信号通路在多种疾病中发挥作用已被研究报道，包括胃癌[4]，结肠腺癌[11]等肿瘤。 在GBM中AEBP1是否通过NF-κB信号通路发挥作用及其具体的机制值得进一步深入研究。