CD155蛋白在胰腺癌组织和细胞系中的表达及其临床意义

周海波，陈 炯，邬高华，胡丕波，何俊飞

胰腺癌是一种恶性程度高的消化系统肿瘤，早期无特异性症状，大多数患者在临床确诊时已处于晚期阶段，虽然目前胰腺癌的治疗手段有了进步，但其5年生存率仅有9%，胰腺癌已成为全球第7大致死癌症[1-2]。CD155蛋白(又称人类脊髓灰质炎病毒受体，poliovirus receptor，PVR)是Nectin样分子家族中的第5个成员，也属于免疫球蛋白超家族成员，是DNAX辅助分子-1(DNAX accessory molecule-1，DNAM-1)的配体，研究表明其在结肠癌、肺癌多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的进展、侵袭、转移及预后等有关[3]。但是关于CD155蛋白的表达与胰腺癌组织之间的关系，目前国内外文献报道较少。该研究运用免疫组织化学法检测胰腺导管腺癌及其癌旁组织中CD155蛋白的表达情况，并分析其与临床病理资料的关系，采用Western blot及qRT-PCR法分析胰腺正常细胞及胰腺癌细胞株中的CD155蛋白及mRNA的表达，旨在探讨CD155表达与胰腺癌组织的相关性及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料人正常胰腺细胞株HPDE6-C7及胰腺癌细胞株Panc-1、BxPC-3、AsPC-1(中科院上海细胞库)。收集安徽医科大学附属省立医院普外科在2016年1月～2019年10月间接收的实施根治性手术切除并经病理证实为胰腺导管腺癌的组织及其对应的癌旁组织(距离癌组织 >2 cm)各92例。被研究者临床资料完整，术前无放化疗。其中：男56例，女36例；年龄40～79(61.43±9.05)岁，<60岁38例，≥60岁54例；胰头癌、胰体尾癌分别为53、39例；高、中+低分化分别为35、57例；TNM分期参照AJCC分期第7版，其中Ⅰ～Ⅱ期54例,Ⅲ～Ⅳ 38例；淋巴结转移及未转移分别为50、42例；神经侵犯55例，未被侵犯37例。本实验均得到医院伦理委员会的批准及患者的知情同意。

1.2 主要试剂胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培养基、DMEM 培养基(美国Hyclone公司)；TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(美国Thermo公司)；CD155一抗(美国CST公司)；二抗、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1细胞培养 胰腺正常细胞(HPDE6-C7)、胰腺癌细胞(BxPC-3、AsPC-1)使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，胰腺癌细胞(Panc-1)使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，4种细胞均静置于37 ℃、5%CO2条件下恒温培养，2～3 d换液传代。

1.3.2Western blot 从培养基中分别收取胰腺正常细胞及3株胰腺癌细胞，加入RIPA细胞裂解液提取蛋白，按照1 ∶4加入5×上样缓冲液。沸水浴加热10 min冷却后上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，半干转法将蛋白质转移至PVDF膜; 5%脱脂奶粉封闭；滴加稀释过的CD155一抗，4 ℃过夜；加入适当稀释度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,室温孵育2 h后PBST洗涤3次，随后加入ECL曝光显影并使用Im-age J软件进行条带分析。

1.3.3qRT-PCR 按照TRIzol试剂盒提取胰腺正常细胞及3株胰腺癌细胞的RNA,根据逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。使用qPCR试剂盒进行扩增反应,反应体系为10 μl。以β-actin为内参，上游引物：5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′；CD155上游引物：5′-CCAGTGAGCACTCAGGTACA-3′，下游引物：5′-GTCTGTGGATCCTGGGAAGA-3′。采用2-ΔΔCt计算mRNA表达量，实验重复6次。

1.3.4免疫组化 石蜡包埋标本3 μm连续切片，脱蜡后柠檬酸盐高压修复，缓慢冷却至室温，然后使用内源性过氧化物酶阻断剂消除内源性过氧化物酶活性(30 min)，PBS冲洗3次，再滴加一抗CD155(1 ∶200)，4 ℃过夜，次日室温下放置 30 min，PBS冲洗3次，随后滴加二抗孵育30 min，PBS冲洗3次，加入适量DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，烘箱烘干，最后中性树脂封片。

2 结果

2.1 CD155蛋白在正常胰腺细胞及3株胰腺癌细胞中的表达Western blot结果提示CD155蛋白在正常胰腺细胞和胰腺癌细胞中均有表达，但是在胰腺正常细胞中表达较低，HPDE6-C7 、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3中CD155平均灰度值分别为(0.27±0.03)、(1.15±0.08)、(0.82±0.06)、(0.63±0.03)，四组之间差异有统计学意义(F=135.99，P<0.01),在胰腺癌细胞中由低到高的顺序为BxPC-3、AsPC-1、Panc-1，与HPDE6-C7比较，差异有统计学意义(t=15.59、15.50、17.08，P<0.01)。见图1、2。

图1 胰腺正常细胞和3株胰腺癌细胞中CD155蛋白表达情况

图2 胰腺正常细胞和3株胰腺癌细胞中CD155蛋白表达量

2.2 CD155 mRNA在正常胰腺细胞及3株胰腺癌细胞中的表达差异PCR结果显示CD155 mRNA在正常胰腺细胞及3株胰腺癌细胞均有表达，HPDE6-C7、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3中CD155 mRNA平均表达水平分别为(1.00±0.15)、(5.02±0.39)、(2.79±0.28)、(1.67±0.06)，四组之间差异有统计学意义(F=295.82,P<0.05)。与正常胰腺细胞HPDE6-C7比较,胰腺癌细胞(BxPC-3、AsPC-1、Panc-1)中mRNA表达量均比正常胰腺细胞高，其差异有统计学意义(t=10.38、14.13、17.08，P<0.01)，且mRNA结果与Western blot中CD155蛋白表达结果相一致。见图3。

图3 胰腺正常细胞和3株胰腺癌细胞中CD155 mRNA表达量

2.3 CD155蛋白在胰腺导管腺癌和癌旁正常组织中的表达免疫组化结果显示CD155蛋白主要表达在胰腺导管腺癌组织的细胞膜上，胰腺导管腺癌组织中阳性表达率为65.22%(60/92),癌旁组织中阳性表达率为38.04%(35/92)，其差异有统计学意义(χ2=13.60，P<0.01)。见图4。

图4 CD155蛋白在胰腺导管腺癌和胰腺癌组织中表达情况 ×200

2.4 CD155蛋白的表达与胰腺导管腺癌临床资料的相关性CD155蛋白的表达与胰腺导管腺癌的分化程度、神经浸润、淋巴结转移有关(χ2=12.451、16.614、10.551，P<0.05),而与患者的性别、年龄、肿瘤位置、TNM分期等无关。见表1。

表1 胰腺导管腺癌组织中CD155蛋白的表达与临床病理关系 (n)

3 讨论

DNAM-1(又称DNAX辅助因子-1、CD226)是一种分子量为65 000的免疫球蛋白样跨膜糖蛋白，可表达于NK细胞、T淋巴细胞、单核细胞和一部分B细胞的表面，CD155作为DNAM-1的配体，可分为膜表达型(mCD155)和可溶型(sCD155)两种形式；有研究[3-5]报道DNAM-1受体与靶细胞膜表面配体CD155结合后可促使免疫细胞(如NK细胞、T细胞)活化，释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性分子并诱导靶细胞的凋亡，CD155由于其突出的免疫功能，最近在肿瘤免疫学领域备受关注，与健康组织相比，CD155在人类恶性肿瘤中高表达，可与活化或抑制性受体结合参与免疫功能调节。

CD155与多种肿瘤的发生、发展紧密相连。Triki et al[6]对158例乳腺癌标本通过免疫组化发现CD155在乳腺癌中呈现高表达，其主要表达于细胞膜和细胞质中，细胞膜上CD155表达与NK细胞浸润有关，并且细胞膜上高表达CD155的乳腺癌组织NK细胞浸润的密度越高，相比较细胞膜上低表达CD155的乳腺癌患者，具有更好的预后和更高的生存率。Kearney et al[7]发现健康患者来源的NK细胞杀伤急性髓系白血病(AML)细胞需依赖CD155与DNAM-1的结合，当AML细胞不表达或低表达CD155时，不能促使NK细胞活化，降低了NK细胞裂解靶细胞的能力，而高表达CD155的AML细胞,NK细胞对其杀伤作用强，当使用硼替佐米上调低CD155表达的AML细胞，增强了NK细胞杀伤AML细胞的杀伤能力，这表明CD155的表达高低直接影响到DNAM-1依赖的NK细胞对AML细胞的杀伤作用的强弱。虽然这些研究显示CD155高表达是诱导肿瘤凋亡的有利因素，但是也有研究表明抑制CD155的表达而发挥抗肿瘤作用。Zheng et al[8]用免疫组织化学方法检测了97例结肠癌组织和癌旁正常组织的CD155表达情况，结果表明CD155在结肠癌中的表达比癌旁组织高，同时Western-blot方法也证实了结肠癌组织和细胞中CD155的高表达，分析与临床病理间的关系发现CD155的表达与结肠癌AJCC分期和转移相关，表明CD155的过度表达与结肠癌的进展有关，进一步的实验研究显示CD155基因敲除能抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭、转移以及促进结肠癌细胞的凋亡，其可能通过上调促凋亡分子和抑制抗凋亡分子的表达而发挥作用。上述的这些研究结果表明CD155的表达在不同肿瘤中发挥着重要的免疫功能，CD155可能成为肿瘤治疗的新靶点，这为治疗胰腺癌提供了新思路，或许能够调控CD155的表达来探索胰腺癌治疗的新方法。

本研究通过免疫组化法检测了92例胰腺导管腺癌组织和及其配对的癌旁正常组织中CD155的表达情况，结果显示胰腺导管腺癌组织中CD155表达高于癌旁正常组织，主要表达于胰腺导管腺癌组织的细胞膜上。为了验证CD155在胰腺癌中的转录和翻译水平，本课题组设计了Western blot和qRT-PCR两项实验来检测胰腺癌细胞系和正常胰腺细胞CD155的表达，结果显示胰腺癌细胞系中CD155蛋白和mRNA水平均高于正常胰腺细胞，其结果与免疫组化的结果相一致。进一步分析显示CD155蛋白表达与胰腺导管腺癌的分化程度、神经侵犯及淋巴结转移均有相关性，而与患者其它临床资料无相关性。有研究[9-10]表明癌症患者中DNAM-1受体表达降低或sCD155表达增加，降低了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。Lee et al[11]发现双阴性T细胞能通过DNAM-1与急性髓系白血病表面的CD155结合而发挥抗肿瘤作用，当阻断DNAM-1受体后，其杀伤肿瘤细胞的能力降低。这表明DNAM-1与CD155的有效结合是免疫细胞杀伤肿瘤细胞的所依赖的途径。根据这些研究者的发现，所以本研究推测胰腺癌患者中可能也出现DNAM-1的减少，导致机体内免疫细胞不能充分与胰腺癌表面的高表达的CD155结合，或者因sCD155的增多，与mCD155竞争结合DNAM-1受体,使活化的免疫细胞减少，从而降低了对肿瘤细胞的杀伤，使得胰腺癌得以进展。本实验结果提示CD155在胰腺癌中的高表达可能与胰腺癌的发生、发展及预后存在一定的相关性，CD155的检测可能有助于评估胰腺癌患者的临床病情。

综上，本研究表明CD155蛋白在胰腺导管腺癌中高表达，且与胰腺导管腺癌的分化程度、神经浸润及淋巴结转移有相关性，这些结果提示CD155可能参与了胰腺癌的发生、发展，提示CD155可能是预测胰腺癌预后的生物学标志物，同时因其的免疫功能，CD155有望成为胰腺癌治疗的新靶点。课题组后期将通过体外细胞阻断实验研究免疫细胞是否通过CD155/DNAM-1途径杀伤胰腺癌细胞，进一步阐述CD155高表达在胰腺癌中的作用。