基于重组酶聚合酶扩增技术的犬冠状病毒快速检测方法的建立

陈 坚，张丹琳，马 磊，伍妙梨

(1.广西柳州畜牧兽医学校，广西 柳州 545003 ； 2.广东省实验动物监测所，广东 广州 510633)

犬冠状病毒病、犬瘟热与犬细小病毒病是犬的三大烈性传染病，其中，犬瘟热与犬细小病毒病流行较广、危害较大，已引起广大宠物饲养者与销售者的高度重视，但目前对犬冠状病毒了解不多，重视不够，近年来该病发病率逐年增加，对养犬业造成的危害越来越严重[1-3]。

犬冠状病毒病是一种以犬胃肠炎为主的高度接触性传染病。该病发病急、传染快、病程短，对幼犬的危害尤其严重，是引起幼犬急性胃肠炎的重要病毒之一[4]。该病由犬肠道冠状病毒(Canine coronavirus,CCoV)引起，为单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目、冠状病毒科、α冠状病毒属[5]。病毒粒子多呈圆形或椭圆形，囊膜表面带有冠状病毒典型的树突状的“冠”，并呈放射状整齐地排布于整个病毒粒子表面。CCoV主要有4种结构蛋白，分别是跨膜蛋白M，纤突蛋白S，核衣壳蛋白N和膜蛋白E，其中S蛋白与病毒的致病性、免疫原性和细胞毒性密切相关，可与细胞受体相作用，引起细胞融合，是诱导机体产生中和抗体的主要成分[6]。

鉴于CCoV常与犬瘟热、犬细小病毒、肠道寄生虫等混合感染，由于缺乏完善的CCoV检测手段，经常容易出现误诊，故需要临床症状结合实验室诊断尚能对其进行确诊。目前，国内诊断犬冠状病毒可采用病毒分离鉴定和血清学诊断等方法[7]。PCR是近年来快速发展的一种可用于病原体检测的技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，而被广泛应用于动物疾病的检测、临床诊断等。目前，应用于CCoV检测的技术包括RT-PCR和荧光定量RT-PCR，这些检测方法通常需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，在现场检测中不具备优势，因此，需要更简便的技术来提高检测效率[8]。等温核酸扩增技术为快速检测技术带来新的曙光[9-10]。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA) 利用特殊的酶在25～43 ℃条件下即可打开模板链，并进行扩增，反应时间更短且不需要热变性[11]。与传统PCR相比既降低了检测成本，且不受限于检测场地[12]。本试验建立了一种用于CCoV的快速检测重组酶聚合酶扩增检测方法(Reverse-transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)，并用于临床样品的检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPA试剂，购自杭州众测生物科技有限公司。PrimerscriptTMone step RT-PCR kit、DH5α感受态细胞，均购自宝生物工程(大连)有限公司。基因组DNA/RNA共抽提试剂盒、DNA产物纯化试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司。pGEM-T easy 载体、RiboMAX Large Scale RNA Production System T7试剂盒，均购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。犬冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，购自北京天恩泽基因科技有限公司。

1.2 病毒株和临床样品 犬冠状病毒、犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)由本实验室分离保存。犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒(CAV)核酸由本实验室保存提供。25份临床样品为犬粪便，由本地的宠物医院提供，并于-20 ℃保存。

1.3 引物的设计及合成 根据NCBI上CCoVM基因的保守区域设计特异性引物(表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 所用的引物序列信息

1.4 RNA的提取及RNA标准品的制备 按照基因组DNA/RNA共抽提试剂盒使用说明书分别提取CCoV、CDV、CPV等病毒及临床样品的核酸，并于-20 ℃保存备用。采用表1中的CCoV-F3和CCoV-F4引物，以CCoV病毒基因组RNA为模板进行扩增，获取大小为680 bp的目的片段。使用DNA纯化试剂盒对扩增产物进行纯化后连接到pGEM-T easy载体上，并转化DH5α感受态细胞。挑取转化的单克隆抽提质粒并进行测序鉴定，获得重组质粒pGEM-T-CCoV。使用限制性内切酶NdeI对重组质粒进行线性化处理，并对酶切产物进行纯化回收，随后用RiboMAX Large Scale RNA Production System T7试剂盒进行体外转录，以获得体外转录的CCoV RNA。

1.5 RT-RPA反应 参照试剂盒说明书配制RT-RPA反应体系，其中A Buffer 41.5 μL、B Buffer 2.5 μL、CCoV F1/F2各2 μL、病毒RNA 2 μL。反应条件为35 ℃恒温孵育15 min。随后使用普通DNA产物纯化试剂盒对RPA产物进行纯化，并取5 μL产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察并分析电泳结果。

1.6 特异性和敏感性分析 以犬其他常见病毒CDV、CPV、CAV、CPIV等核酸为模板进行RT-RPA反应，评估所建立的CCoV RT-RPA检测方法的特异性。对体外转录的CCoV 标准RNA进行10倍系列稀释，选取浓度为1×108拷贝/μL～1×100拷贝/μL作为RT-RPA敏感性分析的模板，以确定所建立的方法的检出限，每个样品做2个重复，并进行3次重复试验。

1.7 临床样品检测 以所建立的RT-RPA方法对25份临床样品进行检测，并同时与Real-time RT-PCR方法的检测结果进行比较。

2 结果

2.1 RT-RPA反应条件的优化 利用方阵试验进行RT-RPA的反应温度(30、32、35、37、40 ℃和42 ℃)和孵育时间(10、15、20 min和25 min)的优化。结果表明，35 ℃反应15 min时所扩增的目的条带最亮，故本试验中RT-RPA的最佳反应条件为35 ℃,15 min。

2.2 特异性和敏感性分析 以其他病毒DNA/RNA为模板进行CCoV RT-RPA特异性试验，结果表明，所建立的RT-RPA方法具有良好的特异性，仅针对CCoV有特异性扩增条带，而对CDV、CPV、CAV、CPIV等其他常见病原无任何特异性扩增(图1)。

以1×108～1×100拷贝/μL体外转录RNA为模板进行扩增，结果显示,所建立的RT-RPA方法的最低检出限为1×102拷贝/μL(见图2)，3次重复试验结果一致。

图1 CCoV RT-RPA检测方法的特异性分析Fig.1 Specificity analysis of RT-RPA for CCoV detectionM：DL-2 000 DNA Marker； 1：CDV； 2：CPV；3：CCoV； 4：CAV； 5：CPIV； 6：阴性对照M：DL-2 000 DNA Marker； 1：CDV； 2：CPV；3：CCoV； 4：CAV； 5：CPIV； 6：Negative control

图2 CCoV RT-RPA敏感性分析结果Fig.2 Sensitivity analysis of RT-RPA for CCoV detectionM：DL-2 000 DNA Marker； 8～0：1×108～1×100拷贝/μL的体外转录RNA； NC：阴性对照M：DL-2 000 DNA Marker； 8～0:In vitro transcriptional RNA of 1×108～1×100 copies/μL; NC：Negative control

2.3 临床样品的检测 使用所建立的RT-RPA方法及荧光定量RT-PCR方法对25份临床样品进行CCoV检测，并对其检测结果进行比对。结果(见表1)显示2种检测方法的符合率一致，阳性检出率均为48%(12/25)。

3 讨论

CCoV是一种犬的肠道病原体，患病幼犬出现呕吐、腹泻、脱水甚至死亡，为了有效预防和控制CCoV的感染及传播,建立一种快速、敏感的检测方法至关重要[13]。本试验所建立的RT-RPA检测技术具有特异性好、敏感性高等特点，为CCoV的检测提供了一种简单、便捷、准确、可靠的方法。RPA技术与普通PCR技术相比，最大的优点是不需要在较高的温度循环下对模板进行变性和扩增，利用特殊的酶在25～43 ℃条件下打开模板并完成对核酸的扩增。因为不需要热变性，反应时间更短，而且不依赖昂贵的设备即可完成[14-15]。本试验通过序列分析，针对CCoVM基因的保守区域设计并合成引物，建立了RT-RPA检测方法并实现对25份临床样品的精准检测。目前所建立的CCoV RT-RPA方法为基础型RPA技术，为了排除反应体系中的组分对电泳结果的干扰，一般需对扩增产物进行回收后方可进行琼脂糖凝胶电泳，不利于临场检测。通过在RPA扩增基础体系中加入不同的酶及荧光探针，可实现多样化的RPA检测，如荧光定量RPA、侧流层析RPA (LF-RPA)等[16-17]。

表2 RT-RPA和普通PCR检测CCoVTable 2 The comparison of RT-RPA and conventional PCR for CCoV detection

综上所述，本试验建立了CCoV 的RT-RPA快速检测方法，35 ℃恒温条件15 min即可实现对目的片段的有效扩增，具有操作简单、特异性好、敏感性高等优点，可应用于犬CCoV的快速检测。