池州野生黑灵芝多糖的提取及性质研究

2020-09-10 07:22刘静汪雨黄劲松
农产品加工·下 2020年1期
关键词:池州提取灵芝

刘静 汪雨 黄劲松

摘要:为了进一步开发我国传统中草药中的活性和保健成分,以池州山区野生灵芝为研究对象,通过水热提取和乙醇沉淀,采用单因素和三水平三因素正交表L9(34)设计试验,经分析计算确定灵芝多糖的最佳提取工艺条件为提取温度80 ℃,浸提时间35 min,料液比1∶20,提取3次,灵芝多糖的提取率可达到5.45 mg/g;经红外光谱图分析,多糖为β -吡喃葡聚糖。

关键词:灵芝;多糖;提取;正交;池州;提取率

中图分类号:TQ461      文献标志码:A    doi:10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2020.01.037

Abstract:In order to further develop traditional Chinese herbal medicine and health care ingredients,Chizhou Ganoderma lucidum as the research object in our study,by hot water extraction and ethanol precipitation,using the 3 factors of single factors and three levels orthogonal table L9(34) design of experiment,the analysis and calculation to determine the optimum ext-raction conditions of Ganoderma lucidum polysaccharide,temperature 80 ℃,the leaching time of 35 min,and solid-liquid ratio 1∶20,extracting 3 times,the yield of Ganoderma lucidum polysaccharide reached 5.45 mg/g. The polysaccharides were determined by IR spectra,shows that was β-pyran glucan.

Key words:Ganoderma atrum;polysaccharose;extract;orthogonality;Chizhou;extraction

灵芝是我国的宝贵中草药文化遗产,含有多种活性成分,对灵芝活性成分研究不但可以提高我国中草药利用价值,还可以发扬传统优秀文化在当代的价值[1-3]。灵芝多糖具有抗肿瘤作用,灵芝多糖可以通过促进白细胞介素Ⅱ的生成,通过促进单核巨噬细胞的吞噬功能,通过提升人体的造血能力尤其是白细胞的指标水平,以及通过其中某些有效成分对癌细胞起到抑制作用,成为抗肿瘤及癌症辅助治疗的优选药物[4-6]。研究结果表明,灵芝多糖的抗肿瘤活性可能与其对宿主机能的影响有关,且水溶性多糖也可能起着很重要的作用,并且灵芝多糖有其合适的分子量范围,它的分子量越大,抗肿瘤活性越强[7-9]。此外,灵芝多糖具有一定的免疫调节功能,经腹腔注射或经口服灵芝多糖,能增强对蛋白质抗原延迟超过敏化[10]。灵芝多糖能促进T淋巴细胞的转化而增强细胞免疫力;促进淋巴细胞的形成反应,从而增强体液免疫力;增强淋巴细胞内DNA聚合酶的活性,促进细胞的增殖、分裂,导致白细胞介素的合成和分泌,从而恢复因衰老而导致的免疫力下降。再次,灵芝多糖有保护心脑血管的功能[11-12]。研究结果表明,灵芝多糖有明显的强心降压作用,对动脉粥样硬化有预防和治疗作用;其降低血糖原理可能是由于血浆胰岛素水平被提高,使葡萄糖的代谢速度加快,外周组织和肝的葡萄糖利用也加快,从而达到血糖降低的作用。还有研究表明,灵芝多糖可有效地扩张冠状动脉,增加冠脉血的流量,改善心肌微循环,加强心肌氧和能量的供给,可明显使血胆固醇、甘油三酯和脂蛋白降低,可以防止动脉粥样硬化斑块的形成[13-16]。

灵芝多糖能促进血清、肝脏和骨髓的核酸及蛋白质的生物合成,因此可以有效地抗病毒;灵芝多糖可显著提高SOD活性,有效清除机体产生的自由基,从而阻止自由基对机体的损伤,防止机体的过氧化,保护了细胞组织,延缓了细胞衰老。灵芝多糖能显著促进细胞核内DNA合成能力,并可增加细胞的分裂代数[17-19]。这些作用都能延缓机体的衰老,所以,灵芝多糖的抗衰老功能十分强大。除了具有上述保健功能外,还有其他的药用效果,如平缓咳嗽、化痰止咳,缓解支气管哮喘症状、慢性支气管炎。可使过敏反应介质的释放被阻断,使过敏反应减轻;对于中枢神经系统有较强的调节作用,可以安神补脑,保证良好的睡眠质量;可以使其他降压药物的效果更延长和稳定。灵芝多糖还可以保持和调节皮肤水分,恢复和保持皮膚弹性,使皮肤中黑色素的形成和沉淀的速度延缓[20]。

池州黑灵芝产于皖南山区,应用为保健食品已有2 000多年的传统,但是目前利用现代科学研究方法对其进行研究较少,从提取、结构等方面进行初步研究。

1   材料与方法

1.1   试剂和仪器

乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖、乙醚、石油醚、正丁醇、氯仿,以上试剂均为分析纯,国药集团上海试剂公司提供。

R201D型旋转蒸发器,上海广英仪器有限公司产品;WD750B型微波炉,顺德市格兰仕电器实业有限公司产品;Delta-320型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品;BSZ-100A型分部收集器、HL-1B型恒流泵,上海沪西分析仪器厂产品;SYC-15型恒温水浴锅,河北润联科技有限公司产品;WK-150A型超微粉碎机,济南达威机械有限公司产品;FTIR 8700型傅里叶变换红外光谱仪,美国Thermo Nicolet公司产品。

1.2   试验步骤

1.2.1   灵芝多糖的脱蛋白

采用Sevage法脱除蛋白。称取少量灵芝粉样品加少量水溶液(大约有10 mL),取样品液10 mL,加入氯仿-正丁醇(预先配成一定体积比的混合液比例为1∶4)2.5 mL,置于萃取装置中,充分振荡,取上层清液。反复脱蛋白3次效果最佳。

1.2.2   灵芝多糖的透析

(1)透析袋的处理。将透析袋放在装有50%的乙醇的热水中煮1 h,在蒸馏水中润洗。

(2)透析处理。将脱蛋白后的多糖液装入透析袋内,用夹子封口,然后将透析袋放入装有大量蒸馏水的大容器中,透析2~3 d,乙醇沉淀、离心、低温干燥,得到灵芝多糖。

1.2.3   灵芝多糖提取率的测定

采用分光光度法进行测定。多糖类成分在硫酸作用下,首先水解成单糖,同时迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚缩合成有色化合物,490 nm處有最大吸收波长[12]。

精密称取葡萄糖20 mg,定容于400 mL容量瓶中,配置成50 μg/mL。取上述溶液0.2,0.4,0.6, 0.8,1.0,1.2 mL分别于6支试管中,加蒸馏水至2.0 mL,加入1.0 mL,15%苯酚溶液(苯酚与蒸馏水的比例为15∶85),摇匀后迅速加入5.0 mL浓硫酸,摇匀后静置10 min,置沸水浴中加热15 min,迅速冷却至室温,以蒸馏水的反应液作空白,于波长490 nm处比色测定A值。以A490为横坐标,对应的糖量值为纵坐标做标准曲线。使用最小乘法做线性回归,得到吸光度(A)与葡萄糖质量浓度(C)的曲线。灵芝多糖提取率按以下公式计算:

称取灵芝多糖5.0 mg,加热水溶解后定容至100.0 mL,取2.0 mL按上述方法测定A490,查标准曲线,计算结果。

1.2.4   灵芝多糖的测定

粉碎50 g灵芝,由于灵芝多糖易溶于热水中,因此采用热水提取法。对于灵芝多糖的提取工艺,主要从以下4个因素来考虑对提取率的影响,为正交试验设计的水平提供有意义的取值范围。

(1)温度对灵芝多糖提取率的影响。称取1 g灵芝粉5份,加入30 mL水,置于温度不同的水浴锅中,控制温度分别为50,60,70,80,90 ℃,浸提30 min,过滤,滤液离心,苯酚-硫酸法测定灵芝多糖质量浓度,计算提取率。

(2)料液比对灵芝多糖提取率的影响。称取1 g灵芝粉5份,分别加入水15,20,25,30,35 mL置于80 ℃的水浴中,浸提30 min,过滤,滤液离心,计算提取率。利用苯酚-硫酸法测定灵芝多糖质量浓度。

(3)提取时间对灵芝多糖提取率的影响。称取  1 g灵芝粉5份,加入30 mL水,控制温度80 ℃,分别浸提20,25,30,35,40 min,抽滤,滤液经离心后用苯酚-硫酸法测定灵芝多糖质量浓度,计算提取率。

(4)提取次数对灵芝多糖提取率的影响。称取  1 g灵芝粉5份,加入30 mL水,控制温度80 ℃,分别提取1,2,3,4,5次,每次30 min,合并提取液,滤液离心,计算提取率。

2   结果与分析

2.1   提取温度对灵芝多糖提取率的影响

提取温度对灵芝多糖提取率的影响见图1。

由图1可知,伴随提取温度的升高,多糖的提取率渐渐升高,这表明温度越高对灵芝细胞的破坏作用越大,有利于多糖的浸出。由图1可知,提取温度为80 ℃时,灵芝多糖的提取率最高,因此最适宜提取温度为80 ℃。

2.2   料液比对灵芝多糖提取率的影响

料液比对灵芝多糖提取率的影响见图2。

随着料液比的增加,多糖提取率逐渐降低,料液比为1∶20,1∶25时,多糖提取率都为最大。而容积体积的增加会延长浓缩时间,能量消耗较大,生产成本增加,所以料液比为1∶20较好。

2.3   提取次数对灵芝多糖提取率的影响

提取次数对灵芝多糖提取率的影响见图3。

由图3可知,提取次数对灵芝多糖提取率的影响也较为突显。当提取次数1~3次时,多糖提取率增加较快;3~5次时,多糖提取率上升相当迟缓。此外,提取次数较多时,提取液较稀,浓缩过程能耗大。所以,提取次数选3次为宜,是从节约成本和提高效率的方面考虑的结果。

2.4   提取时间对灵芝多糖提取率的影响

提取时间对灵芝多糖提取率的影响见图4。

由图4可知,灵芝多糖提取率随着浸提时间的增加而逐渐增加,30 min后,提取率减少,而随着时间的延长,生产时间也相应延长,生产成本会增加,因此浸提时间为30 min。

2.5   水提法提取灵芝多糖的正交优化

因素与水平设计见表1。

通过单因素试验,利用三水平三因素正交L9(34)试验对工艺进行了优化。

灵芝多糖提取正交设计见表2。

按正交试验设计,共进行9次提取,各个因素影响灵芝多糖提取率的排列顺序为C>B>A,最佳的提取条件为C2B3A2,即提取温度80 ℃,提取时间35 min,料液比1∶20,灵芝多糖的提取率可达到5.45 mg/g。提取温度为80 ℃时,水分子运动剧烈,使灵芝多糖运动加快,灵芝细胞膨胀,细胞壁对多糖的束缚力减弱,多糖在胞内和胞外的渗透压差变大,溶液内外浓度平衡较快。提取时间低于35 min时,胞内外多糖没达到平衡;提取时间大于35 min时,较高的温度将破坏多糖,引起多糖降解。料液比大于1∶20时,溶液过稀,给后续浓缩带来困难;料液比小于1∶20时,胞内多糖浸出较困难。

2.6   红外光谱图鉴定

灵芝多糖的红外光谱图见图5。

由图5可知,在波长3 000~3 800 cm-1处出现一个较宽的糖分子内部或分子之间氢键O-H伸缩振动引起的峰[13],2 950 cm-1处的吸收是亚甲基(-CH2)的C-H伸缩振动峰,1 637cm-1处应为-CHO的C=O伸缩振动引起的吸收峰,而1 390 cm-1处的尖锐峰可能为C-H变角振动,与2 950 cm-1处的吸收振动峰构成了糖类的特征吸收峰[14]。1 130 cm-1处的吸收峰可能为糖环的特征吸收峰,是由多糖中链接单糖的C-O糖苷键振动引起[15]。此光谱图表明所得产品是多糖。

3   结论

通过正交优化试验确定灵芝多糖的最佳工艺提取条件为提取温度80 ℃,提取时间35 min,料液比1∶20,提取次数3次,灵芝多糖产率可达到5.45 mg/g。在这些条件之中溫度的改变对多糖提取率的影响相对较大,其次是提取时间、料液比。目前,此方法仅限于实验室提取灵芝多糖,对其在体内的代谢及对细胞修复方面需进一步深入研究。

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