降胆固醇益生菌发酵剂的制备

李大鹏

摘 要：以前期筛选出来的降胆固醇益生菌嗜酸乳杆菌S 59为出发菌株，对冻干发酵剂的制备工艺进行研究和优化。结果表明：菌悬液的离心收集条件为5 000 r/min、20 min;通过单因素试验和响应面优化试验，确定冻干保护剂为脱脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%，细胞存活率可达90.1%。冻干发酵剂的保藏条件为在真空条件下-4℃保藏。

关键词：降胆固醇益生菌;真空冷冻干燥;离心;保护剂;保藏

目前，具有降胆固醇功能的益生菌的研究及功能性食品的开发主要集中在具有降胆固醇功能的益生菌的筛选、鉴定及体内和体外降胆固醇机理的研究[1 3]，但目前对具有降胆固醇功能的益生菌发酵剂的制备工艺鲜有研究。在发酵乳制品中已广泛使用经离心、冷冻、干燥制备的乳酸菌发酵剂，这种发酵剂易于保证复配菌种的比例，可防止菌种失活，可减少杂菌污染和省去菌种扩培过程[4]。目前，此类产品在我国及欧美等发达国家己得到广泛研究和应用[5]。但未见具有降胆固醇等特殊功能益生菌发酵剂的生产。本研究以前期筛选具有降胆固醇功能的益生菌嗜酸乳杆菌S 59[6]为出发菌株，分析冻干菌剂制备过程中的离心条件、冻干保护剂的种类对菌剂性能的影响，并研究制备的冻干菌剂的保存特性，为降胆固醇功能益生菌发酵食品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌悬液 嗜酸乳杆菌S 59悬浮液，在优化的培养基中和优化的条件下制备。

1.1.2 主要试剂 脱脂乳，完达山牌，市售。甘油、海藻糖，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液离心条件的选择 将嗜酸乳杆菌S 59在100 mL三角瓶中装入优化的液体培养基中，在最适的培养条件下进行培养后，将培养液移入灭过菌的离心管中，分别在4℃、不同离心条件（转速、时间）下收获菌体，经无菌生理盐水洗涤2遍后用于活细胞计数[7]。

1.2.2 冻干保护剂的确定

（1）冻干保护剂的单因素试验：将培养、离心后制备的嗜酸乳杆菌S 59的菌泥，测定活菌数N0，按照保护剂∶菌泥为（w/v）2∶1进行配比，充分混匀后，分装至冻干瓶中，-40℃预冻6 h，在冷阱温度-51℃，真空度0.09 MPa下冷冻22～24 h。

分别将脱脂乳配成2%、4%、6%、8%、10%、12%的浓度，将海藻糖配成1%、2%、3%、4%、5%的浓度，将甘油配成1%、2%、3%、4%、5%的浓度，以蒸馏水为空白对照，冻干后将冻干瓶在 20℃保藏48 h后，取出在30℃水浴中解冻后，测定活菌数N1，计算存活率[8]。

（2）冻干保护剂的响应面法优化：根据单因素试验结果设计三因素三水平的响应面优化试验。

1.2.3 冻干发酵剂保存性测定 将真空冷冻干燥后的发酵剂装入无菌的铝箔聚酯复合袋内在真空和常压包装，分别在-4℃和室温下保藏2个月和4个月，进行活菌计数。

2 结果与分析

2.1 离心条件的确定

由表1可以看出，当离心转速较低时，4 000 r/min时，细胞收集过程中有些小细胞不易被收集，但当离心转速较高时，6 000 r/min时，容易导致细胞的死亡，使活细胞数较低，因此，较适宜的离心收集条件为5 000 r/min、20 min。

2.2 冻干保护剂的确定

2.2.1 冻干保护剂的单因素试验

（1）脱脂乳对冻干菌剂细胞存活率的影响：脱脂乳的成分主要是蛋白质和糖类，其水溶液是胶体溶液，其中蛋白质的直径较小，细菌颗粒处于蛋白质分子的包围之中，可阻止细胞内大的冰晶的形成，有助于保持细菌活性[9]。由图1可以看出，当脱脂乳浓度小于8%时，随

着脱脂乳浓度的增加，细胞存活率显著增大，当脱脂乳浓度大于8%时，随着脱脂乳浓度的增加，细胞存活率不再显著增加，因此，通过单因素确定的脱脂乳适宜浓度为8%。

（2）海藻糖对冻干菌剂活菌数的影响：海藻糖是一种非还原性双糖，在蛋白质冻干过程中，海藻糖会

填补到因为蛋白质失水而产生的空缺当中，从而有效地防止微生物及蛋白质在冻干过程中发生的蛋白质的变性[10]。由图2可以看出，海藻糖浓度对细胞存活率影响显著，随着海藻糖浓度的增加细胞存活率逐渐提高，但当海藻糖浓度增加到4%时，随着海藻糖浓度的增加，细胞存活率的提高不显著，因此，通过单因素试验确定海藻糖适宜浓度为4%。

（3）甘油对冻干菌剂活菌数的影响：甘油，既能透过微生物的细胞壁又能透过细胞膜，在冻干的过程中能通过水合作用使溶液的粘性增加，减弱水的结晶过程，从而起到保护细胞的作用[11]。由图3可以看出，甘油浓度对细胞存活率影响显著，随着甘油浓度的增加，细胞存活率逐渐提高，但当甘油浓度增加到3%时，随着甘油浓度的增加，细胞存活率的提高不显著，因此，通过单因素试验确定甘油适宜浓度为3%。

2.2.2 冻干保护剂的响应面优化试验

（1）响应面试验设计及结果：以单因素确定的脱脂乳8%、海藻糖4%、甘油3%为中心点，进行三因素三水平的响应面优化试验（表2、表3）。

（2）回归分析：由SAS软件進行脊岭分析，得到保护剂联合使用最大细胞理论存活率为89.554%，最佳保护剂配方为脱脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%。以最佳保护剂进行3次冷冻干燥试验，得到平均细胞存活率为90.1%。

2.2.3 凍干发酵剂保存性测定 将冻干后的发酵剂，分别在真空和常压下包装，分别在-4℃和室温下保藏2个月和4个月，进行活菌计数。由表4可以看出，相同的保藏温度下，真空保藏后发酵剂中的活菌数高于常压保藏，在相同的真空度下，-4℃的低温保藏后发酵剂中的活菌数高于室温下保藏，因此，确定制备的冻干发酵剂在真空条件下-4℃保藏。

3 结论

（1）通过离心转速和时间对细胞存活率的影响，确定离心收集条件为5 000 r/min、20 min。（2）通过单因素试验和响应面优化试验，确定冻干保护剂为脱脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%，冻干过程中细胞存活率可达90.1%。（3）通过对制备的冻干保护剂保藏条件对细胞活菌数的影响，确定了制备的冻干发酵剂的保藏条件为在真空条件下-4℃保藏。

参考文献

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Preparation of Fermentation Starter of Probiotics with Cholesterol Lowering Ability

LI Da peng

（School of Chemistry and Material Engineering，Chaohu University，Hefei 238000，China）

Abstract：Using the probiotics Lactobacillus acidophilus S 59 with cholesterol lowering ability selected in the early as starting strain，the preparation process of the freeze drying fermentation starter was studied and optimized.Results showed that the centrifugal collection conditions of bacterial suspension was 5 000 r/min，20 min.By single factor experiment and response surface optimizing method of strain protective agent in vacuum freeze drying，the optimum protective agent of skimmed milk 8.95%，trehalose 5.24% and glycerin 4.54% was determined.And at these conditions，the cell living rate was reached to 90.1%.The condition store was at -4℃ under the condition of vacuum.

Keywords：probiotics with cholesterol lowering ability;vacuum freeze drying;centrifugal;protective agent;store