ALK5抑制剂的设计、合成及其生物学活性评价

许 涛，王小伟，刘晓蓉，王亚洲*，李志裕

（1中国药科大学药学院，南京210009；2南京圣和药业股份有限公司，南京211100）

转化生长因子家族配体包括TGF-βs、抑制素、激活素、骨形成蛋白、生长和分化因子，在细胞增殖、分化、凋亡、迁移、细胞外基质表达和免疫应答等众多过程中都发挥着重要作用［1-2］。TGF-β 活化后，在细胞表面与TGF-β RII 结合并使其激活，活化的TGF-β RII 募集并结合TGF-β RI（ALK5）形成异源三聚体复合物，通过激活Smad2/3 将信号传导至胞浆，Smad2/3 再与Smad4 结合形成复合物，然后转入细胞核以调节各种靶基因的转录［3］。除了经典的Smad 途径外，TGF-β 还可激活非Smad途径，如促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路等［4］。

以往研究报道，在乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌等多种肿瘤类型中，TGF-β 及其信号通路高表达［5］。TGF-β 信号转导在介导肿瘤微环境的原发性改变和促进肿瘤细胞转移、侵袭和免疫逃逸过程中发挥重要作用［6-7］。作为TGF-β 信号通路中的重要节点蛋白，ALK5 是治疗TGF-β 信号转导异常相关疾病的理想靶标，也是目前针对TGF-β 信号通路开发小分子抑制剂的主要靶标。

目前共有6个ALK5小分子抑制剂进入临床研究阶段，其中公开结构的有3 个（图1）。LY-3200882 是礼来公司开发的新一代ALK5 抑制剂，通过ATP 竞争结合位点抑制ALK5 激酶活性，阻断TGF-β 与其受体结合。LY-3200882 是一种强效的ALK5 激酶抑制剂（IC50= 90 nmol/L），在多个实验动物肿瘤模型中也表现出显著的抗肿瘤活性，目前正处于实体瘤治疗的Ⅱ期临床试验［8］。

Figure 1 ALK5 inhibitors in clinical phase

为了寻找新型ALK5 激酶抑制剂，本研究选取LY-3200882 作为先导化合物，通过分析LY-3200882与ALK5蛋白的作用方式（图2），发现母核C 区的吡啶氮原子作为氢键受体与激酶铰链区His283 骨架的NH 之间形成一个关键的氢键作用，在吡唑环所处的选择性口袋中，存在一个水分子介导的氢键作用。以往研究报道，这两个氢键相互作用分别对化合物的ALK5 激酶抑制活性和p38 MAPK选择性至关重要［9］。

Figure 2 Proposed binding mode of LY-3200882(pdb code：2wou)

根据以上分析，对活性起关键作用的母核C区予以保留，利用生物电子等排、构象限制等策略，结合分子对接技术，设计了两类结构新颖的化合物（图3）。首先，通过改造处在溶剂区的侧链得到A 系列化合物，探索理化性质对抑制活性的影响，初步确定A 区优势基团，进而改造另一端侧链得到B系列化合物，以期筛选出活性和成药性更优的化合物。

Figure 3 Molecular design based on the structure of LY-3200882

1 合成路线

目标化合物的合成如路线1 所示。化合物1与2-氯吡啶-4-醇在DMF中用碳酸钾为碱反应得到化合物2，再与DMF-DMA 反应形成化合物3，经水合肼关环生成化合物4，随后与烷基化试剂环丙基硼酸在Chan-Lam 偶联条件下反应得到化合物5，最后和相应的胺经Buchwald-Hartwig 偶联得到目标化合物。

Scheme 1 Synthetic route of the target compounds

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Bruker Avance ⅢHD 400 MHz 型核磁共振仪（德国Bruker 公司，TMS 为内标）；Q Exactive 高分辨质谱仪（美国Thermo 公司）；MP70 型熔点仪（瑞士Mettler-Toledo 公司）；Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；所用化学试剂均为市售化学纯或分析纯产品，一般均不经纯化处理直接使用。

ALK5 激酶（Carna 公司，批号09-141）；Bright-Glo Luciferase assay system（美国Promega 公司）；Luc-Smad2/3-NIH3T3 小鼠成纤维细胞，由中国药科大学徐晓军研究员实验室馈赠。

雄性BALB/c 小鼠，体重（18～22 g），购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（苏）2016-0010。

2.2 化学合成

2-（（2-氯吡啶-4-基）氧基）-1-（四氢-2H-吡喃-4-基）乙-1-酮（2）

氩气保护下，将化合物1（1.45 g，7.0 mmol）的无水DMF（5 mL）溶液加入到2-氯-4 羟基吡啶（0.91 g，7.0 mmol），碳酸钾（1.48 g，14.0 mmol）和无水DMF（20 mL）的混合物中，升温至90 ℃反应2 h。降至室温，加入饱和食盐水，乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂得红色油状物1.47 g，收率82%，ESI-MS（m/z）：257.1［M+H］+。

（E）-2-（（2-氯吡啶-4-基）氧基）-3-（二甲基氨基）-1-（四氢-2H-吡喃-4-基）丙-2-烯-1-酮（3）

将化合物2（1.47 g，5.74 mmol），1，1-二甲氧基三甲胺（3.24 mL，24.4 mmol）加热至100 ℃回流反应2 h。冷却，加入乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，旋干溶剂得棕色油状物1.78 g，收率99%，ESI-MS（m/z）：312.0［M+H］+。

2-氯-4-（（3-（四氢-2H-吡喃-4-基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶（4）

将化合物3（1.78 g，5.74 mmol）溶于醋酸溶液60 mL 中，冰浴下用恒压滴液漏斗加入水合肼（3.0 g，60.0 mmol），室温反应过夜。加入乙酸乙酯，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂得棕色粗品1.05 g，无需纯化，直接用于下一步，ESI-MS（m/z）：281.1［M+H］+。

2-氯-4-（（1-环丙基-3-（四氢-2H-吡喃-4-基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶（5）

将2，2′-联吡啶（0.70 g，4.4 mmol），乙酸铜（0.80 g，4.4 mmol）和1，2-二氯乙烷（10 mL）于75 ℃反应25 min，冷却至室温。加入化合物4（1.12 g，4.0 mmol），环丙基 硼 酸（0.69 g，8.0 mmol）和碳酸钠（0.85 g，8.0 mmol），氧气氛围下，75 ℃反应2 h。冷却至室温，加入饱和食盐水，二氯甲烷萃取，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，柱色谱纯化得黄色固体1.10 g，收率86%；mp：112～114 ℃。ESI-MS（m/z）：320.1［M+H］+。

4-（（1-环丙基-3-（四氢-2H-吡喃-4-基）-1H-吡唑-4-基）氧基）-N-（2-（三氟甲基）吡啶-4-基）吡啶-2-胺（A1）

氩气保护下，将化合物5（192 mg，0.60 mmol），2-三氟甲基-4-氨基吡啶（119 mg，0.78 mmol），4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽（69 mg，0.12 mmol），醋酸 钯（13.5 mg，0.06 mmol），碳 酸 铯（293 mg，0.90 mmol）溶于1，4-二氧六环15 mL，加热至100 ℃反应过夜。冷却，加入饱和食盐水，二氯甲烷萃取，无水Na2SO4干燥，旋干溶剂，制备HPLC 纯化得白色固体85 mg，收率31%；mp：168～170 ℃；纯度96.7%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.96（1H，s，pyrazole-H），8.45（1H，d，J=5.4 Hz，pyridine-H），8.25（1H，s，NH），8.22（1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H），7.90（1H，s，pyridine-H），7.80（1H，d，J=4.4 Hz，pyridine-H），6.70（1H，d，J=4.7 Hz，pyridine-H），6.40（1H，s，pyridine-H），3.83（2H，d，J=11.1 Hz，OCH2），3.69（1H，s，CH），3.30（2H，d，J=13.3 Hz，OCH2），2.72（1H，m，CH），1.67（4H，s，2-CH2），1.06（2H，s，CH2），0.96（2H，d，J=6.0 Hz，CH2）；HR-MS（ESI）for C22H22F3N5O2［M+H］+：Calcd. 446.179 8；Found 446.179 2。

4-（4-（（4-（（1-环丙基-3-（四氢-2H-吡喃-4-基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）氨基）吡啶-2-基）-2-甲基丁-3-炔-2-醇（A2）

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成4-（4-氨基吡啶-2-基）-2-甲基丁-3-炔-2-醇，得白色固体25 mg，收率18%；mp：110～112 ℃；纯度92.8%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.60（1H，s，pyrazole-H），8.23（1H，d，J=5.5 Hz，pyridine-H），8.18（1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H），7.89（1H，s，pyridine-H），7.89（1H，s，NH），7.46（1H，d，J=4.5 Hz，pyridine-H），6.64（1H，d，J=4.6 Hz，pyridine-H），6.36（1H，s，pyridine-H），5.57（1H，s，OH），3.83（2H，d，J=11.1 Hz，OCH2），3.67（1H，m，CH），3.29（2H，s，OCH2），2.86～2.66（1H，m，CH），1.66（4H，s，2-CH2），1.48（6H，s，2-CH3），1.05（2H，s，CH2），0.99～0.91（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C26H29N5O3［M+H］+：Calcd. 460.234 3；Found 460.233 6。

N-（2-（1H-吡唑-4-基）吡啶-4-基）-4-（（1-环丙基-3-（四氢-2H-吡喃-4-基）-1H-吡唑-4-基基）氧基）吡啶-2-胺（A3）

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成2-（1H-吡唑-4-基）吡啶-4-胺，得淡黄色固体65 mg，收 率33%；mp：111～113 ℃；纯 度97.7%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：13.02（1H，s，NH），9.49（1H，s，pyrazole-H），8.24（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.18（1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H），8.04（2H，s，pyrazole-H），7.88（1H，s，NH），7.85（1H，s，pyridine-H），7.51（1H，d，J=5.3 Hz，pyridine-H），6.61（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），6.39（1H，s，pyridine-H），3.83（2H，d，J=11.3 Hz，OCH2），3.75～3.61（1H，m，CH），3.33（2H，d，J=4.2 Hz，OCH2），2.88～2.64（1H，m，CH），1.67（4H，s，2-CH2），1.03（2H，s，CH2），0.96（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C24H25N7O2［M+H］+：Calcd.444.214 2；Found 444.213 3。

2-（2-（4-（（4-（（1-环丙基-3-（四氢-2H-吡喃-4-基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）氨基）吡啶-2-基）苯基）丙-2-醇（A4）

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成2-（2-（4-氨基吡啶-2-基）苯基）丙-2-醇，得白色固体117 mg，收率67%；mp：195～197 ℃；纯度94.8%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.61（1H，s，pyrazole-H），8.38（1H，d，J=5.5 Hz，pyridine-H），8.20（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.14（1H，s，Ar-H），7.92（1H，s，NH），7.90（2H，s，Ar-H），7.66（1H，d，J=5.3 Hz，Ar-H），7.58（2H，d，J=7.8 Hz，pyridine-H），6.63（1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H），6.41（1H，s，pyridine-H），5.09（1H，s，OH），3.84（2H，d，J=11.2 Hz，OCH2），3.68（1H，m，CH），3.33（2H，m，OCH2），2.75（1H，m，CH），1.69（4H，s，2-CH2），1.47（6H，s，2-CH3），1.06（2H，s，CH2），0.96（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C30H33N5O3［M+H］+：Calcd.512.265 6；Found 512.264 6。

4-（4-（（4-（（1-环丙基-3-（四氢-2H-吡喃-4-基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）氨基）吡啶-2-基）四氢-2H-吡喃-4-醇（A5）

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成4-（4-氨基吡啶-2-基）四氢-2H-吡喃-4-醇，得白色固体85 mg，收率28%；mp：92～94 ℃；纯度96.6%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.53（1H，s，pyrazole-H），8.24（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.14（1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H），7.88（1H，s，NH），7.78（1H，s，pyridine-H），7.71（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），6.59（1H，d，J=7.8 Hz，pyridine-H），6.38（1H，s，pyridine-H），5.18（1H，s，OH），3.83（2H，d，J=8.6 Hz，OCH2），3.79～3.70（4H，m，2-OCH2），3.70～3.63（1H，m，CH），3.31（2H，m，OCH2），2.79～2.63（1H，m，CH），2.17（2H，m，CH2），1.66（2H，m，CH2），1.40（2H，d，J=12.9 Hz，CH2），1.04（2H，m，CH2），1.00～0.86（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI） for C26H31N5O4［M+H］+：Calcd.478.244 9；Found 478.244 0。

4-（4-（（4-（（1-环丙基-3-（4，4-二氟环己基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）氨基）吡啶-2-基）四氢-2H-吡喃-4-醇（B1）

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-（四氢-2H-吡喃-4-基）乙-1-酮换成2-溴-1-（4，4-二氟环己基）乙烷-1-酮，得白色固体170 mg，收率26%；mp：56～58 ℃；纯度96.9%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.52（1H，s，pyrazole-H），8.24（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.14（1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H），7.88（1H，s，NH），7.77（1H，d，J=1.9 Hz，pyridine-H），7.70（1H，dd，J=5.6，2.1 Hz，pyridine-H），6.58（1H，dd，J=5.8，2.2 Hz，pyridine-H），6.38（1H，d，J=2.2 Hz，pyridine-H），5.17（1H，s，OH），3.73（4H，m，2-OCH2），3.67（1H，m，CH），2.68（1H，m，CH），2.16（2H，m，CH2），2.01（2H，m，CH2），1.86（4H，m，2-CH2），1.68（2H，m，CH2），1.40（2H，d，J=12.7 Hz，CH2），1.04（2H，m，CH2），0.97～0.92（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C27H31F2N5O3［M+H］+：Calcd. 512.246 8；Found 512.246 6。

4-（4-（（4-（（3-（3- 唑环［3.1.0］己-6-基）-1-环丙基-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）胺基）吡啶-2-基）四氢-2H-吡喃-4-醇（B2）

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-（四氢-2H-吡喃-4-基）乙-1-酮换成1-（3-氧杂环［3.1.0］己烷-6-基）-2-溴乙烷-1-酮，得白色固体135 mg，收率14%；mp：63～65 ℃；纯度98.2%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.52（1H，s，pyrazole-H），8.24（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.14（1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H），7.85（1H，s，NH），7.78（1H，d，J=1.8 Hz，pyridine-H），7.69（1H，dd，J=5.6，2.0 Hz，pyridine-H），6.59（1H，dd，J=5.8，2.2 Hz，pyridine-H），6.43（1H，d，J=2.1 Hz，pyridine-H），5.17（1H，s，OH），3.80～3.70（6H，m，3-OCH2），3.69～3.64（1H，m，CH），3.59（2H，m，OCH2），2.17（2H，m，CH2），1.87（2H，d，J=8.0 Hz，CH2），1.62（1H，t，J=7.8 Hz，CH），1.41（2H，d，J=12.8 Hz，CH2），1 . 04（2H，m，CH2），0.96-0.92（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C26H29N5O4［M+H］+：Calcd. 476.229 2；Found 476.228 1。

4-（4-（（4-（（1-环丙基-3-苯基-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）氨基）吡啶-2-基）四氢-2H-吡喃-4-醇（B3）

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-（四氢-2H-吡喃-4-基）乙-1-酮换成2-溴-1-苯乙烷-1-酮，得白色固 体65 mg，收 率21%；mp：137～139 ℃；纯 度

99.6%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.49（1H，s，pyrazole-H），8.23（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.16（1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H），8.12（1H，s，NH），7.76（1H，d，J=1.6 Hz，pyridine-H），7.70（2H，d，J=7.4 Hz，Ar-H），7.66（1H，dd，J=5.6，1.9 Hz，pyridine-H），7.36（2H，t，J=7.6 Hz，Ar-H），7.28（1H，d，J=7.4 Hz，Ar-H），6.67（1H，dd，J=5.8，2.1 Hz，pyridine-H），6.43（1H，d，J=2.0 Hz，pyridine-H），5.17（1H，s，OH），3.82（1H，m，CH），3.79～3.63（4H，m，2-OCH2），2.16（2H，m，CH2），1.39（2H，d，J=12.9 Hz，CH2），1.16（2H，m，CH2），1.04（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C27H27N5O3［M+H］+：Calcd. 470.2187；Found 470.2180。

4-（4-（（4-（（1-环丙基-3-（2-氟苯基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）氨基）吡啶-2-基）四氢-2H-吡喃-4-醇（B4）

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-（四氢-2H-吡喃-4-基）乙-1-酮换成2-溴-1-（2-氟苯基），得白色固体32 mg，收率22%；mp：67～69 ℃；纯度93.6%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.50（1H，s，pyrazole-H），8.23（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.16（1H，s，NH），8.09（1H，d，J=5.9 Hz，pyridine-H），7.76（1H，d，J=1.8 Hz，pyridine-H），7.67（1H，dd，J=5.6，1.9 Hz，pyridine-H），7.54（1H，m，Ar-H），7.44～7.35（1H，m，Ar-H），7.27～7.16（2H，m，Ar-H），6.57（1H，dd，J=5.8，2.2 Hz，pyridine-H），6.43（1H，d，J=2.1 Hz，pyridine-H），5.19（1H，s，OH），3.90～3.81（1H，m，CH），3.80～3.64（4H，m，2-OCH2），2.16（2H，m，CH2），1.38（2H，d，J=12.9 Hz，CH2），1.22～1.12（2H，m，CH2），1.04（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C27H26FN5O3［M+H］+：Calcd.488.209 2；Found 488.208 5。

4-（4-（（4-（（1-环丙基-3-（3-氟苯基）-1H-吡唑-4-基）氧基）吡啶-2-基）氨基）吡啶-2-基）四氢-2H-吡喃-4-醇（B5）

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-（四氢-2H-吡喃-4-基）乙-1-酮换成2-溴-1-（3-氟苯基），得白色固体28 mg，收率19%；mp：117～119 ℃；纯度99.8%；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.51（1H，s，pyrazole-H），8.24（1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H），8.17（1H，d，J=5.9 Hz，pyridine-H），8.15（1H，s，NH），7.77（1H，d，J=1.4 Hz，p yridine-H），7.67（1H，dd，J=5.5，1.8 Hz，pyridine-H），7.54（1H，d，J=7.8 Hz，Ar-H），7.48～7.35（2H，m，Ar-H），7.18～7.07（1H，m，Ar-H），6.69（1H，dd，J=5.8，2.1 Hz，pyridine-H），6.44（1H，d，J=1.9 Hz，pyridine-H），5.17（1H，s，OH），3.84（1H，m，CH），3.80～3.67（4H，m，2-OCH2），2.16（2H，m，CH2），1.40（2H，d，J=12.9 Hz，CH2），1.22～1.15（2H，m，CH2），1.09～0.98（2H，m，CH2）；HR-MS（ESI）for C27H26FN5O3［M+H］+：Calcd. 488.209 2；Found 488.208 5。

2.3 ALK5激酶抑制活性评价

将化合物溶解于指示剂量的DMSO 中（从10µmol/L 按3倍稀释），用Echo转移化合物100 nL到384 孔反应板中。将ALK5 激酶加入1 倍激酶缓冲 液（40 mmol/L Tris，pH 7.5，0.10% BSA，20 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT）中，形成2 倍酶溶液，向384 孔反应板中加入2.5 µL，室温孵育10 min。将FAM 标记的多肽和ATP 加入1 倍激酶缓冲液，形成2 倍底物溶液，并转移2.5 µL 至384 孔反应板，于28 ℃孵育120 min。转移反应液5µL到一块新的384孔板反应孔中，加入ADP-Glo试剂5µL终止反应，于28 ℃孵育120 min。转移激酶检测试剂10 µL 到反应孔中，振荡1 min，室温静置30 min。在Envision上读取发光值。

2.4 NIH3T3细胞活性评价

Luc-Smad2/3-NIH3T3 细胞 于10 cm 培养皿 中正常培养至汇合度达90%，消化后收集至15 mL 离心管中，1 000 r/min 离心5 min 后，去除上清液，用培养基1 mL重悬后，稀释10倍计数，根据计数后的结果稀释细胞，将每孔4 000个细胞数传入96孔板中（每孔加入重悬细胞100µL）。称取化合物2 mg，使用DMSO 配制成4 mmol/L 母液，用2% FBS 培养基稀释，加入1×化合物溶液100µL，使其终浓度分别为20 000，5 000，1 250，312.5，78.125，19.53，4.88，1.22 nmol/L，每孔TGF β1终浓度为4 ng/mL，与化合物一起用2% FBS 培养基稀释。然后移去细胞上清液，每孔加入Glo Lysis Buffer 100 µL，缓慢摇晃使其均匀溶解细胞，室温裂解5 min。每孔加入Bright-glo luciferase assay system 100µL，室温孵育5 min，振荡2 min，将上清液180µL 转入白底96孔板，检测化学发光信号。

2.5 药代动力学评价

单次口服给药（po）组：10 mg/kg，0.2 mL/10 g；单次尾静脉注射给药（iv）组：1 mg/kg，0.1 mL/10 g，n=3；po或给药后于5、15、30 min，1、2、6、10、24 h自眼眶静脉丛采血于肝素化EP 管（0.6 mL）中，暂置于碎冰上。然后以8 000 r/min 离心5 min，转移上层血浆15 µL，加甲醇-乙腈（1∶1）150 µL 沉淀（含1 ng/mL邻甲苯海拉明），振荡3 min，4 500 r/min，离心5 min，取上清液（容器：2 mL 深孔板）50µL，加入稀释剂（甲醇-水，1∶1）500µL，振荡3 min，4 500 r/min 离心5 min，转移上清液200 µL 用LC-MS/MS进样分析。根据上述步骤所得血药浓度数据绘制血药浓度-时间曲线图，用WinNonlin 软件求算药代动力学参数。

3 结果与讨论

目标化合物的体外活性结果如表1所示。在A系列化合物中，将A 区叔醇替换成吸电子基（A1-A2），激酶抑制活性明显降低。当引入不同环状给电子基（A3～A5）时，抑制活性与阳性药相当或更优，其中化合物A5 的抑制活性（IC50=2.4 nmol/L）最优，比阳性药提升2.5 倍。A 区构效关系表明，引入给电子基有助于增强活性，而吸电子基的引入则会导致活性明显损失。在细胞活性测试中，化合物A5 对NIH3T3 细胞中TGFβ-ALK5-SMAD2/3信号通路表现出较好的抑制活性（IC50= 69.6 nmol/L），于是确定四氢吡喃醇为A区优势基团。

通过固定四氢吡喃醇，利用生物电子等排，将B 区四氢吡喃环替换成二氟环己烷（B1），相比于阳性药，抑制活性显著提高（IC50=3.8 nmol/L），可能是因为二氟甲基的体积较氧原子略大，疏水作用的加强导致抑制活性提高。引入桥环结构（B2）活性与阳性药相当，表明四氢吡喃环上位阻对活性影响相对较小。当用苯环替换四氢吡喃环时（B3），抑制活性得到显著改善，可能苯环与结合口袋中某些氨基酸残基存在π-π堆积作用，使得结合力增强。此外，苯环上取代基及其位置对活性有一定影响，引入氟原子可进一步提高活性，且氟位于邻位时（B4）抑制活性更强（IC50= 1.4 nmol/L），具有阳性药31 倍的优势。在细胞活性测试中，化合物B4 对NIH3T3 细胞中TGFβ-ALK5-SMAD2/3 信号通路表现出最佳的抑制活性（IC50= 14.2 nmol/L）。基于化合物B4 良好的体外抑制活性，对其药代动力学性质做进一步考察。

Table 1 IC50 of the target compounds against ALK5 enzyme and NIH3T3 cell

药代动力学的评价结果如表2 所示。化合物B4 呈现较低的清除率（CL = 5.2 L·h-1·kg-1），暴露量（AUC=1 584.0 ng/mL·h）良好，半衰期为1.8 h，口服生物利用度达到85.0%，基本具备每天一次口服给药的潜力。

Table 2 Pharmacokinetic parameters of compound B4 a

为了进一步说明化合物的构效关系，本研究使用分子对接方法研究了化合物B4 与靶蛋白ALK5 在活性位点的结合模式（pdb：2wou）。通过图4 可以看出，化合物B4（紫色）保留了在ALK5 激酶铰链区与His283 的直接氢键作用，以及选择性口袋中水分子介导的氢键相互作用。另外发现化合物B4 与LY-3200882（绿色）母核部分叠合良好，与LY-3200882 不同的是，溶剂区吡喃环上的羟基与Asp290 形成一个氢键作用，B 区苯环上的对位氢原子与Lys337 形成一个非经典氢键。这些信息为后续ALK5 抑制剂的设计提供了借鉴和理论基础。

Figure 4 Proposed binding mode of B4(purple)and overlaid with LY-3200882(green)

4 小结

本研究通过分析LY-3200882 与ALK5 的结合模式，保留对活性起关键作用的母核区域，利用生物电子等排和构象限制等策略，设计并合成了10个目标化合物。通过两轮优化得到化合物B4，不仅表现出显著的体外抑制活性，而且具备良好的药代动力学性质，具有进一步开发的潜在价值。