人MDM2截短体真核表达载体的构建及其与NLK的相互作用

施 展，刘 莲，袁仕善，张慧慧

（湖南师范大学医学院，长沙 41006）

由TP53基因编码的P53蛋白是一种关键的肿瘤抑制因子，在调控细胞正常生长、调节细胞周期、抑制恶性增殖等方面具有重要作用［1］。MDM2（murine double minute 2）是P53蛋白的负调控因子，能够与P53蛋白直接相互作用，抑制其转录活性，并泛素化P53蛋白使其通过蛋白酶体途径降解［2］。NLK（Nemo-like kinase）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是一种保守进化型的促分裂原活化蛋白激酶［3］。作者前期研究发现，细胞周期特异性抗肿瘤药物依托泊苷（etopside）处理结肠癌细胞HCT116可以促进P53蛋白表达，同时NLK也有高表达，过表达NLK可以提高P53蛋白的稳定性，NLK与P53之间有相互作用，且存在NLK与MDM2竞争性与P53相互作用的现象［4］，但其机制尚未完全明确。本文构建MDM2的N端和C端两个截短体，探究NLK与MDM2之间的相互作用。

1 材料与方法

1.1 材料人胚肾293 T细胞（293T细胞）、pHAGE-3×HA-linker-C载体由本实验室保存，myc-MDM2 质粒系湖南师范大学生命科学学院周建林教授惠赠，DMEM、PBS购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，0.25%胰酶、双抗（青霉素-链霉素）购自美国MRC公司，限制性内切酶购自美国Thermo Fisher scientific公司、DNA连接酶购自大连宝生物工程公司、2×PCR mix试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；HA、Flag小鼠单克隆抗体购自日本MBL公司，内参GAPDH兔单克隆抗体购自美国Affinity Biosciences公司，HRP 偶联的羊抗兔、羊抗鼠二抗和羊抗鼠轻链二抗购自美国Jackson公司。化学发光液购自测序由湖南擎科生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成根据NCBI数据库中人MDM2基因编码序列（CCDS8986.2），设计扩增MDM2-N（7-301AA），MDM2-C（294-497AA）片段所需的引物，MDM2-N-F： 5’…cgGGATCCATGTGCAATACCAACA TGTC…3’，MDM2-N-R： 5’…ccgCTCGAGAGGATCTT CTTCAAATGAAT…3’；MDM2-C-F： 5’…cgGGATCC ACAGATTCATTTGAAGAAGA…3’，MDM2-C-R：5’…ccgCTCGAGCTAGGGGAAATAAGTTAGCA…3’（小写为保护碱基，斜体为酶切位点）。委托湖南擎科生物技术有限公司合成，并予PAGE纯化。

1.2.2 MDM2-N和MDM2-C的扩增、克隆及测序以myc-MDM2质粒为模板，以MDM2-C-F/ R、MDM2-N-F/R为引物扩增目的片段。反应体系50μL：2×Phata Mix buffer 25μL，Fidelity DNA Polymerase 1μL，dNTP mix 1μL，上、下游引物各2μL，MDM2模板1μL，ddH2O补至50μL。PCR反应条件 ：95℃预变性 5 min；95℃ 变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸60 s（N端）/45 s（C端），28个循环；72℃终延伸5min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用试剂盒回收目的片段。

用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ酶切上述PCR回收产物和pHAGE-3×HA-linker-C载体，琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。按载体：目的片段=1：4，将酶切后的MDM2-N，MDM2-C分别与与pHAGE-3×HA-linker-C载体用T4连接酶于16℃连接过夜。将连接产物转化至 T1感受态细胞中，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落，菌落PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养过夜，提取质粒进行测序。

1.2.3 细胞转染和Western blot免疫印迹检测接种293T细胞于6孔板中，调整密度使转染时细胞密度达到60%～70%，16 h后进行转染。按转染试剂（μL）：质粒（μg）=1∶1加入无血清培养基中混合均匀，室温静置15 min后，加入6孔板中，37 ℃、5% CO2培养48h后收集细胞，提取蛋白，加入1×SDS上样缓冲液，95 ℃金属浴加热10 min，12000 r/min离心15 min，取上清上样。配置10%浓度的SDS-PAGE胶，电泳完成后转移至硝酸纤维素（NC）膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入1∶5000浓度稀释的Flag一抗4 ℃孵育过夜。PBST 洗膜3次，加入1∶5000浓度稀释的HRP标记的二抗室温孵育1h，PBST 洗膜3次，化学发光显色法显影。

1.2.4 免疫共沉淀检测HA-MDM2-N、HA-MDM2-C与myc-NLK的相互作用HA-MDM2-N、HAMDM2-C单转或者与myc-NLK质粒共转染至293T细胞中，转染48h后收集细胞，用200μL NP40细胞裂解液（0.02M Tris-HCl（pH7.5），0.15M NaCl，1mM EDTA，1% NP40，1mg/mL AP（Aprotinin抑肽酶），1mg/mL LP（Leupeptin 亮肽素），1mM PMSF）裂解细胞，冰上孵育15 min，4 ℃、12000 r/min离心15 min，吸取40μL上清液加入10μL 5×SDS上样缓冲液用作Input样品，剩余细胞裂解液加入0.5μL myc抗体，加入10μL 处理好的Protein A/G磁珠（用NP40裂解液平衡3次），4 ℃旋转过夜孵育。1000 r/min离心1min去除上清液，用500μL裂解液洗涤3次，加入40μL 2×SDS上样缓冲液，95 ℃金属浴加热10 min，离心取上清作为IP样品。Western blotting检测NLK与MDM2-N、MDM2-C的相互作用。

2 结果

2.1 HA-MDM2-N与HA-MDM2-C真核表达载体的构建HA-MDM2-N与HA-MDM2-C真核表达载体经菌落PCR鉴定，扩增片段大小与预期一致（图1A）。阳性克隆经测序鉴定，插入的MDM2-N，MDM2-C序列与人MDM2相应位置序列一致（图1B）。上述结果证明，成功构建HA-MDM2-N与HA-MDM2-C真核表达载体。

2.2 HA-MDM2-N与HA-MDM2-C重组载体在293T细胞中的表达HA-MDM2-N，HA-MDM2-C真核表达载体分别转染293T细胞后，Western blot均检测到HA-MDM2-N，HA-MDM2-C和阳性对照HA-P53的特异表达及内参GAPDH的表达。vector为空载对照，只能检测到GAPDH的表达（图2）。

2.3 HA-MDM2-N，HA-MDM2-C与myc-NLK存在相互作用将HA-MDM2-N、HA-MDM2-C分别与myc-NLK共转染至293T细胞，利用免疫共沉淀技术验证NLK与MDM2截短体的相互作用。结果显示NLK与MDM2-N和MDM2-C均有相互作用，其中NLK与MDM2-C结合较MDM2-N更强（图3）。

3 讨论

图1 重组载体的构建

图2 HA-MDM2-N与HA-MDM2-C在293T细胞中表达HA-P53 ：阳性对照 ；vector：空载 ；

图3 HA-MDM2-N，HA-MDM2-C与NLK存在相互作用

肿瘤抑制因子P53在DNA损伤、原癌基因激活、缺氧等刺激条件下会被激活，调控DNA损伤修复、细胞周期阻滞、细胞凋亡、自噬等相关信号通路。MDM2是P53发挥肿瘤抑制作用的重要调控因子，两者之间形成精密的负反馈调节环路，该环路失衡的后果会导致P53失活引起肿瘤的发生。在没有DNA损伤等外界压力的情况下，细胞中的P53蛋白通过MDM2的调节维持在较低的水平［5］。当有外界压力刺激细胞时，相关信号通路中的蛋白会影响MDM2与P53的相互作用，抑制MDM2对P53蛋白的泛素化降解，增加P53蛋白表达水平，提高P53蛋白活性［6］。目前抑制MDM2与P53之间的相互作用，使P53发挥转录活性成为肿瘤治疗的一种策略。很多蛋白例如p14ARF、E2F1、YB1能够通过影响MDM2与P53的相互作用调控P53的活性［7］。近年来文献报道了大量抗肿瘤通过阻断MDM2-P53的相互作用达到抗肿瘤目的的小分子抑制剂［8］。

NLK通过磷酸化转录因子或者关键信号蛋白分子，调控相关的信号通路。NLK通过磷酸化TCF/LEF负调控 Wnt信号通路［9］，磷酸化 Fox1 抑制其转录活性［10］，磷酸化Notch1-ICD负调控Notch信号通路［11］。NLK还可通过影响蛋白之间的相互作用调控信号通路，抑制TAK1与IKK之间的相互作用调控NF-κB信号通路［12］，与E2F1相互作用抑制E2F1对下游基因的调控［13］。我们前期研究发现NLK不依赖激酶活性而是通过抑制MDM2与P53之间的相互作用抑制P53蛋白的泛素化提高P53蛋白的稳定性。MDM2与P53直接相互作用的核心位置为N端25-107AA，发挥E3泛素连接酶活性的关键位置为C端388-444AA。因此我们构建了包含核心位置带有HA标签的MDM2 N端、C端重组真核表达载体。通过免疫共沉淀验证了NLK与MDM2的N端、C端都有相互作用，NLK与MDM2 C端结合较强。说明NLK能够与MDM2竞争性结合P53，并且能够抑制MDM2泛素连接酶活性稳定P53表达。目前的研究是在没有外界刺激条件下进行的，下一步我们将在有etopside刺激条件下研究NLK与MDM2-N 、MDM2-C的相互作用。进一步完善NLK调控MDM2-P53环路的分子机制。