新疆打瓜籽油中亚油酸的尿素包合纯化工艺研究

胡 力，王芳梅，王 伟，艾合买提江，王 亮

(1.新疆大学 生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046； 2.江苏省产品质量监督检验研究院，南京 210007)

打瓜(Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum. et Nakai)，又名籽瓜，为葫芦科一年生草本植物，是西瓜的一个栽培变种[1]，主产于新疆、甘肃，吉林和内蒙古等地也有种植[2]，因含籽多而得名。打瓜籽含油率可达到50%，油中富含不饱和脂肪酸亚油酸[3]。亚油酸具有多种生理活性，并在降血脂、降血压等方面有独特的药理活性。目前，国内对于打瓜籽油的研究主要集中在提取工艺及功效研究等方面[3-9]，对于打瓜籽油中不饱和脂肪酸的纯化工艺研究鲜有报道。

目前，国内外对多不饱和脂肪酸进行分离的方法有超临界流体萃取法[10]、分子蒸馏法[11-12]、低温结晶法[13]、色谱法[14-15]、尿素包合法[16-19]等。其中，尿素包合法是混合脂肪酸纯化较常用的方法，因具有操作简单、溶剂可回收、纯化成本低等优点而被广泛应用。

本文采用尿素包合法纯化打瓜籽油中的亚油酸，制备高纯度亚油酸，有利于提高打瓜籽油产品的附加值，延长打瓜籽油产业链，可为新疆打瓜籽的深入开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

打瓜籽油，由本实验室经超声波辅助溶剂提取所得。

95%乙醇、氢氧化钠、石油醚、浓盐酸、尿素、氯化钠、环己烷、冰乙酸、韦氏试剂、碘化钾、可溶性淀粉、五水硫代硫酸钠、无水碳酸钠、无水硫酸钠，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

FA1004电子天平；RE-52AA型旋转蒸发仪；MJX-250B-Z型霉菌培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；安捷伦7890A气相色谱仪。

1.2 试验方法

1.2.1 混合脂肪酸的制备

参照李开雄等[20]的方法，略作调整。精确称取25 g打瓜籽油，加入100 mL 4%氢氧化钠乙醇溶液，85℃水浴回流皂化1 h，冷却至室温，加一定量的蒸馏水使皂化物完全溶解，加入石油醚萃取。取下层，再加入适量石油醚进行萃取，除去不皂化物，分液，弃去石油醚层。下层加入10%盐酸调pH至2～3，待可明显看见油层和水层，置于分液漏斗中分层，弃水层，油层用蒸馏水洗至中性，加无水硫酸钠干燥脱水，经旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂，得到混合脂肪酸。

1.2.2 尿素包合法富集打瓜籽油中亚油酸

参考赵萍等[21]的方法，略作调整。将95%乙醇与尿素按一定体积质量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)混合后，高温回流，使得尿素全部溶解，加入一定量的混合脂肪酸(尿素与混合脂肪酸质量比为1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)，80℃下水浴回流30 min，冷却至室温。在一定温度(-20、4、20、30、40℃)下包合一定时间(6、12、18、24、30 h)后，抽滤，滤液经旋转蒸发回收有机溶剂后，用质量分数10%的氯化钠溶液水洗至下层溶液澄清透明无尿素，加无水硫酸钠干燥脱水，即得亚油酸。按下式计算亚油酸得率。

得率=产物质量/混合脂肪酸质量×100%

产物碘值采用 GB/T 5532—2008测定，作为亚油酸纯度的评价指标。

1.2.3 数据处理

每个试验重复 3 次，结果用“平均值 ± 偏差”表示。运用 Graphpad Prism 5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 亚油酸富集单因素试验

2.1.1 乙醇与尿素体积质量比对亚油酸富集的影响

在尿素与混合脂肪酸质量比1.5∶1、包合温度20℃、包合时间12 h条件下,考察乙醇与尿素体积质量比对亚油酸碘值及得率的影响，结果见图1。

图1 乙醇与尿素体积质量比对亚油酸碘值及得率的影响

由图1可知，随着乙醇与尿素体积质量比的增加，尿素在乙醇中的溶解度增加，尿素与脂肪酸有更多的接触机会，从而提高了尿素包合的程度。因此，更多的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸被包合，从而得到更高纯度的亚油酸，碘值上升。但是当乙醇增加到一定量后,碘值有所下降，其原因可能是因为溶剂量过大，尿素包合反应向逆反应方向进行，对饱和、单不饱和脂肪酸的包合程度下降，导致碘值下降[22]。随着乙醇与尿素体积质量比的增加，亚油酸更容易溶解在乙醇中，而被分散系中黏稠络合物非选择性包合的可能性减小，因此亚油酸得率显著升高后趋于稳定[23]。综合考虑，选取乙醇与尿素体积质量比3∶1进行后续试验。

2.1.2 尿素与混合脂肪酸质量比对亚油酸富集的影响

在乙醇与尿素体积质量比3∶1、包合温度20℃、包合时间12 h条件下,考察尿素与混合脂肪酸质量比对亚油酸碘值及得率的影响，结果见图2。

图2 尿素与混合脂肪酸质量比对亚油酸碘值及得率的影响

由图2可知，随着尿素与混合脂肪酸质量比的增加，尿素比例升高，反应中尿素的包合程度增大，从而使得亚油酸纯度升高，碘值上升。亚油酸得率随尿素与混合脂肪酸质量比增大先增加后降低。随着尿素与混合脂肪酸质量比逐渐升高，整个反应体系中乙醇与脂肪酸的比例也在不断扩大，亚油酸更容易溶解在乙醇中，而被分散系中黏稠络合物非选择性包合的可能性减小，因此亚油酸得率呈逐渐上升趋势，但是随着尿素与混合脂肪酸质量比进一步升高，尿素非特异性包合程度增大，即部分亚油酸也被包合，导致得率降低[24]。综合考虑，选取尿素与混合脂肪酸质量比2.5∶1进行后续试验。

2.1.3 包合温度对亚油酸富集的影响

在尿素与混合脂肪酸质量比2.5∶1、乙醇与尿素体积质量比3∶1、包合时间12 h条件下,考察包合温度对亚油酸碘值及得率的影响，结果见图3。

图3 包合温度对亚油酸碘值及得率的影响

由图3可知，随包合温度升高，碘值和得率先升高后降低。包合温度过低，尿素形成包合物晶体速度过快，反应不充分，导致亚油酸纯度即碘值较低，同时由于温度过低使得混合反应物变得浓稠，使抽滤困难，增加滤液中混合脂肪酸的损失，得率也不高。随着包合温度的升高，反应逐渐充分，碘值和得率逐渐升高，包合温度为20℃时碘值、得率均达到最大； 随着包合温度进一步升高，碘值明显降低，得率略有降低。尿素包合物的形成是一个放热过程，在一定范围内，温度降低时反应向生成尿素包合物的方向进行，有利于生成包合物，而温度过高，非选择性包合增加，导致碘值、得率降低。综合考虑，选取包合温度20℃进行后续试验。

2.1.4 包合时间对亚油酸富集的影响

在尿素与混合脂肪酸质量比2.5∶1、乙醇与尿素体积质量比3∶1、包合温度20℃条件下，考察包合时间对亚油酸碘值及得率的影响，结果见图4。

图4 包合时间对亚油酸碘值及得率的影响

由图4可知，亚油酸的碘值随着包合时间的延长呈现先升高后降低的趋势，在包合时间18 h时达到最大，原因是由于在短时间内尿素包合物没有充分形成，不能完全包合饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸，碘值较低，当包合时间延长时，包合效果越来越好，碘值逐渐增大，但随着包合时间的进一步延长，包合反应达到平衡，有一部分不饱和脂肪酸也会被带入到包合相，造成碘值下降。随着反应时间的适当延长，包合产物发生一定程度的沉降，有利于与亚油酸的分离，得率升高；但反应时间的进一步延长，由于尿素包合的选择性变差，部分亚油酸被包合，得率降低。综合考虑，选取包合时间15 h进行后续试验。

2.2 亚油酸富集响应面试验

在单因素试验的基础上，以包合温度、包合时间、乙醇与尿素体积质量比、尿素与混合脂肪酸质量比为考察因素，以样品的综合评分(综合评分=该方案亚油酸得率/所有方案中最高的亚油酸得率×50+该方案样品碘值/所有方案中最高碘值×50)为综合评价指标，进行四因素三水平的Box-Behnken 响应面试验分析。响应面试验因素水平编码见表1，响应面试验设计方案及结果见表2，方差分析见表3。

表1 响应面试验因素水平编码

应用Design-Expert 8.0.6软件对表2试验结果进行二次多项式回归拟合，得到样品的碘值和得率综合评分(Y)对各因素的二次多元回归方程:

表2 响应面试验设计方案及结果

表3 回归方程模型方差分析

Y=94.06+1.90A+2.03B+10.12C+3.70D+0.51AB-2.59AC+0.72AD-4.04BC-0.58BD-1.15CD-0.88A2-1.25B2-7.48C2-5.09D2

应用Design-Expert 8.0.6软件对模型进行计算，得到最优的纯化工艺条件为：包合时间13.3 h，包合温度4.24℃，乙醇与尿素体积质量比4∶1，尿素与混合脂肪酸质量比2.63∶1。在最优工艺条件下，尿素包合法纯化打瓜籽油亚油酸产品的综合评分为98.21。

为试验操作的简便性，将最优工艺修正为：包合时间13 h，包合温度4℃，乙醇与尿素体积质量比4∶1，尿素与混合脂肪酸质量比3∶1。在修正条件下进行3次重复试验，得到尿素包合法纯化打瓜籽油亚油酸产品的综合评分为96.33，与预测值相对误差为1.91%，此时产物的碘值(I)为146.14 g/100 g，得率为46.55%。

2.3 尿素包合前后主要脂肪酸组成(见表4)

表4 尿素包合前后主要脂肪酸组成 %

由表4可看出，经过尿素包合后，绝大多数的饱和脂肪酸被除去，亚油酸含量由72.910%升高至97.249%，亚油酸含量显著提高。

3 结 论

本文采用单因素试验和响应面试验对尿素包合法纯化打瓜籽亚油酸的工艺条件进行优化，得到的尿素包合法富集打瓜籽油亚油酸最优工艺条件为：包合时间13 h，包合温度4℃，95%乙醇与尿素体积质量比4∶1，尿素与混合脂肪酸质量比3∶1。在最优工艺条件下，亚油酸产物的碘值(I)为146.14 g/100 g，得率为 46.55%。气相色谱分析表明，经尿素包合后，产物中主要脂肪酸为油酸和亚油酸，含量分别为1.362%、97.249%，亚油酸含量较打瓜籽油(72.910%)明显升高。