一例河蟹病原体腐败希瓦菌的检测诊疗与分析

陈 瑜 李 勇 倪 亚

(1.泗阳县三庄乡农业经济技术服务中心，江苏 泗阳 223700；2.泗阳县水产技术指导站，江苏 泗阳223700；3.泗阳县倪亚水产技术服务中心，江苏 泗阳 223700)

2019 年8 月26 日笔者接诊泗阳县南刘集渔场黄某的河蟹病样，进行病原细菌的分离培养与检测，并对分离纯化得到的病原菌株进行了药物敏感性试验。经检测该塘河蟹致病菌为腐败希瓦菌，该菌株对硫酸新霉素最为敏感，对其他试验药物敏感性较差。这一检测结果应用于塘口治疗效果较为显著，具体情况如下。

一、病情概述

1.蟹农主诉：年初扣蟹放养规格160 只/千克、密度2 500只/亩，8月底平均规格雄蟹125克/只、雌蟹75 克/只。自8 月初陆续发现河蟹零星死亡，从最初15～20 只/天逐渐发展，1 周后上升至80～100只/天，8月26日200多只发病死亡。其间于当地渔药店多次购药治疗，先后连续21 天服用过恩诺沙星、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠，改底与调水3次，消毒1次，但不见任何效果，病蟹数量不降，越来越多。

2.接诊察看：发病塘口面积30 亩，池形东西长、南北宽，四周环沟宽4米、水深1米，塘中浅水面平均水深0.6 米，水草占比60%。池塘水源充沛、进排水方便。巡塘发现，病蟹趴边、无力、反应迟钝、遇惊不退避，少数病蟹上岸吐沫、易捕捉、翻身不起，外观体色灰暗、四肢较干净。

3.解剖检查：蟹鳃丝棒样水肿，部分黑鳃、烂鳃，肠无食，胃内泡沫样胀气，肝胰腺呈暗黄色、无光泽。

4.寄生虫检查：低倍镜(×10)显微检查鳃丝及附肢绒毛，未见固着类纤毛虫寄生。

5.水质检测：上午10:00检测水质，水体溶解氧5.3 毫克/升、pH 8.3、氨氮0.2 毫克/升、亚硝酸盐0.01毫克/升。

6.水样镜检：池水中以小球藻、栅藻、盘星藻、裸藻等藻类为主，浮游动物见少许桡足类，其浮游生物量丰度适中。

二、病菌分离纯化培养与药物敏感性试验

选取具有典型症状濒死河蟹，于无菌操作实验室内进行细菌分离纯化培养检测鉴定和菌株对药物感受性试验。实验前用75%酒精擦拭消毒河蟹体表，于无菌操作净化台内进行无污染解剖，剪取肝胰腺少许，放入盛有15 毫升经高压灭菌营养肉汤增菌液的50 毫升离心管中，放置于生化培养箱28℃、24 小时增菌培养；18～24 小时后对扩增培养的细菌进行普通营养琼脂平板划线分离接种，重置于生化培养箱中28℃、24 小时培养；18～24 小时挑取培养皿单一菌落，再次划线分离纯化培养(28℃、24 小时)；24 小时后挑取菌落配制成0.5 麦氏浊度菌悬液，按照梅里埃API-20E细菌鉴定试剂条操作流程，将菌悬液滴加到试剂条每个生化反应小杯管中，置于恒温生化培养箱中37℃、24 小时培养，18～24 小时比色判读鉴定。另外，用无菌棉签蘸取1个菌落进行氧化酶反应试验比色判读。鉴定结果：API-20E 生化序号为0600004，菌株为腐败希瓦菌，鉴定率97.2%，革兰氏染色阴性、杆菌。菌株生化反应鉴定判读结果见表1。

表1 API-20E鉴定试剂条生化反应判读结果

同时，用移液枪吸取配制好的0.5麦氏度菌悬液0.2毫升，加到20毫升无菌生理盐水中在V形槽内混匀，然后用微量移液排枪吸取加入到药敏板所有微孔中(阴性对照除外)，每孔加0.2毫升，置于35℃培养箱培养18～24 小时。药敏试验操作依据南京菲恩动物用药敏分析96 孔试剂板操作流程。试验结果见表2。

药敏试验表明：本次河蟹染病病原体腐败希瓦菌对8种所试药物的感受性，对硫酸新霉素强敏感，MIC 为0.39 微克/毫升，为本次疾病治疗的首选用药；而恩诺沙星为25微克/毫升、盐酸多西环素为50 微克/毫升、磺胺甲噁唑＋甲氧苄啶为(512＋102)微克/毫升，病原菌株对这3 种药物耐受性极强，属低敏感度，最小抑菌浓度值相对较高，用药的血药浓度必须达到较高峰值才可抑菌见效，选药上要慎重，尽量不选；其他4种药物在设置浓度试验范围内无法抑制病菌繁殖，该菌株对其耐药，选药时彻底舍弃。

三、试验结果应用

经实验室检测诊断此次河蟹致病病原体为腐败希瓦菌。症状表现为鳃丝水肿，部分烂鳃，胃胀气，肠炎，蟹背胸甲溃疡、腐壳等。应用菌株药敏试验结果，筛选试验强敏感药物硫酸新霉素处方内服，剂量为河蟹每千克体重5 毫克(以新霉素计)，每天1 次，连用7 天，同时外泼氨基酸碘1次。治疗3天后死蟹减半，5天后减少至10 只/天，7 天后死蟹消失，河蟹摄食量上升，活力变强，病情得以控制。

四、分析与小结

1.本病例提示细菌性病害应求病原鉴定与药敏试验选药的精准性，不可囿于以往的盲选药物。此病例在没做药敏试验前，养殖户选恩诺沙星、氟苯尼考、磺胺类等药物用了21 天未见效果，其原因在于此病致病菌为腐败希瓦菌，而经药敏试验，该菌株对恩诺沙星、盐酸多西环素、氟苯尼考、甲砜霉素、氟甲喹、磺胺类等表现为低敏甚至不敏，盲目用药必致无效。相反，找准极敏感药物硫酸新霉素给病蟹用药，效果立显。

2.本次药敏试验发现，当地腐败希瓦菌对多种药物都有较强耐药性，这给因该菌株感染的病害防控选药上带来一定的困难，增加了治疗难度。

3.本病例如排除池塘生态环境诱病因素外，应当考虑河蟹长期投喂冰冻海鱼的影响，一些已变质而未被发现的冻鱼投喂是否存在携带腐败希瓦菌病原的可能性，有待于进一步溯源检测。

表2 8种药物对河蟹腐败希瓦菌株最小抑菌浓度(MIC)试验结果 微克/毫升