紫薯花色苷果胶/海藻酸钙复合凝胶球的制备及性能研究

陈芳，张悦，唐静，李俊杰

(重庆工商大学 环境与资源学院，重庆 400067)

花色苷是一类广泛存在于果蔬花草等高等植物中的化合物，一些发达国家已将其开发为药品和保健食品[1]。紫薯花色苷是从紫薯中提取出的一种花色苷，具有降血压、降血脂、抗氧化、防突变、抗肿瘤、保护肝脏和预防心血管疾病等功效[2]。但由于其母核连有许多羟基，易受环境中氧、热、pH、光等影响导致分子异构、聚合和降解，从而导致天然花色苷易降解褪色[3]。因此，如何提高花色苷的稳定性，提高人体吸收率，一直备受关注。

为了提高紫薯花色苷的生物利用率，本实验制备了海藻酸钠与果胶的天然复合钙凝胶珠，去包埋紫薯花色苷，并分析果胶与海藻酸钠的浓度比例、氯化钙溶液浓度、交联时间对凝胶珠质地、对紫薯花色苷的包埋率的影响。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

橘皮果胶(APC230，酯化度35)，由烟台安德利果胶有限公司提供；紫薯花色苷(纯度10%)，由陕西森朗生物化工有限公司提供；海藻酸钠(食用级)，由青岛明月海藻集团有限公司提供；氯化钙(食品级)，由浙江一诺生物科技有限公司提供；氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氢氧化钠、盐酸、甲醇、乙醇等均为分析纯。

TA-XT plus质构仪；UV1102Ⅱ型紫外可见分光光度计；900-CN pH计；T09-1S恒温磁力搅拌器；HJ-6A多头磁力搅拌器；ZWY-110X30型恒温培养振荡箱；LGJ-18S型冷冻干燥机；XKA-2200台式低速离心机；SU8020扫描电子显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 紫薯花色苷橘皮果胶钙凝胶球的制备 按照一定比例分别称取相应质量的样品，溶于30 mL蒸馏水中，并在恒温磁力搅拌器上搅拌30 min(1 000 r/min、20 ℃)，将混合均匀的溶液离心(4 000 r/min、10 min)，以去除溶液表面气泡，然后移入注射器(20 mL)中，备用。将胶体溶液室温滴入不同浓度的氯化钙溶液中搅拌，移出在去离子水中搅拌4 min以清洗凝胶珠，于室温下培养皿中保存。

1.2.2 单因素实验 在果胶1.5 g，白砂糖2.7 g，紫薯花色苷0.075 g，去离子水30 mL时，选取变量胶凝时间(1，2，3，4，5 min)、果胶与海藻酸钠比例(4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1)、氯化钙溶液浓度(1%，3%，6%，9%，12%)3个可能影响凝胶珠质构和包封率的因素，按照1.2.1节方法进行单因素实验以确定各单因素的适宜范围。

1.2.3 果胶钙凝胶球制备条件优化 采用正交实验，对果胶钙凝胶球制备条件进行优化，其因素和水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 质构分析 使用质构仪对凝胶珠进行TPA质地测定，采用直径35 mm圆柱形探头P36R，测试条件确定如下：预测试速度1.0 mm/s，测试速度和测后速度均为0.5 mm/s，目标模式是strain，凝胶珠的压缩量为30%，使用触发力为0.05 N的Auto(Force)触发型，皮重模式为Auto。每项测试重复3次，取硬度和弹性数据进行极差分析，选取最优组。

1.2.5 紫薯花色苷橘皮果胶钙凝胶球载药量及包封率的测定

1.2.5.1 制作标准曲线 精密称取0.1 g样品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，制成 1 mg/mL 溶液。然后分别取出2，4，6，8，10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至10 mL。利用紫外分光光度计，在527 nm下测量5种不同浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg/mL)溶液的吸光度值，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘成曲线。

图1 紫薯花色苷标准浓度曲线Fig.1 The calibration curve of purple sweet potato anthocyanin

由图1可知，紫薯花色苷的标准曲线回归方程为：y=0.743x-0.073(r=0.996)，由标准曲线可知，紫薯花色苷浓度在0.2～1.0 mg/mL范围内，线性关系良好。

1.2.5.2 样品中紫薯花色苷的测定 从烘箱中取出干燥后的样品，用研钵做粗略粉碎后称取1 g样品于100 mL锥形瓶中。用移液管移取25 mL甲醇于锥形瓶。之后用分散仪进行进一步粉碎，直至小颗粒变为细微的粉末。将锥形瓶瓶口用橡胶塞密封，防止甲醇挥发。将锥形瓶放置在阴凉避光的场所提取24 h。将提取液于4 000 rad/min下离心 10 min。移取上清液于比色皿中。以甲醇为空白对照，将紫色分光光度计波长设置为527 nm，测定样品溶液对应吸光度值[4]。

1.2.6 溶胀性能研究 干燥的凝胶珠溶胀性通过在缓冲液中进行实验。具体方法为：精密称取干燥后的凝胶珠，分别放在装有25 mL缓冲溶液(pH分别为：4.0，7.0，9.0)的带盖培养皿中，25 ℃恒温水浴，然后间接性的(每过1 h)将凝胶珠取出并且用滤纸吸干其表面的水分并在电子天平上称重[5]。溶胀系数通过以下公式计算：

ESR=(WEs-Wd)/Wd

溶胀比为：SR= (WS-Wd)/Wd

其中，ESR为平衡溶胀比；WEs为水凝胶达到平衡溶胀时的质量；SR为溶胀比；WS为水凝胶不同时间段的溶胀质量；Wd为凝胶珠干燥质量。

1.2.7 体外缓释 模拟胃液：KCl(1.12 g/L)，NaCl(2.0 g/L)，CaCl2(0.11 g/L)，KH2PO4(0.4 g/L)，用盐酸将 pH 调整为
1.2。模拟肠液就用碳酸氢钠将上述溶液pH调整至6.8。模拟结肠液就在肠液中用碳酸氢钠将pH调为7.4并加入果胶酶。取新鲜制备的凝胶珠，加入到100 mL装有模拟胃液的锥形瓶中，锥形瓶放置在恒温振荡箱中(150 r/min，37 ℃)2 h，其中每隔30 min用紫外分光光度计检查紫薯花色苷的含量。然后重新收集凝胶珠转移到模拟肠液中，每隔 30 min 检测溶液中紫薯花色苷的含量。直到2 h 后，转移至模拟结肠液中，每隔 30 min检测紫薯花色苷的含量[6]。

1.2.8 扫描电镜 利用扫描电子显微镜(SEM)观察凝胶球的表面形貌。将冷冻干燥的样品粘到导电胶上，在真空下喷金，加速电压设置为10.0 kV，分别在35倍和100倍下对凝胶球的整体形态结构和剖面形态进行观察。剖面的制作是将样品放置于液氮中，用刀子切面即可。

2 结果与讨论

2.1 果胶与海藻酸钠质量比对凝胶珠机械性能的影响

微胶囊的功能性与其化学与机械稳定性密切相关。若微球容易变形，则微胶囊就比较容易受到破坏造成包容物被提前释放。不同果胶与海藻酸钠质量比对凝胶珠机械性能的影响见表2。

表2 果胶与海藻酸钠质量比对凝胶珠机械性能的影响Table 2 Effect of mass ratio of pectin/alginate on the mechanical properties of gel beads

由表2可知，随着果胶与海藻酸钠质量比的增大，凝胶珠的硬度呈现增大的趋势，而弹性却无显著性变化。这是因为海藻酸钠的黏性比果胶大，因此当凝胶珠中海藻酸钠较大时，凝胶珠间粘性变大，硬度降低，而随着果胶与海藻酸钠的质量比例增大至7∶1时，凝胶珠的黏性减小，脆性和硬度增大。梁娇旸之前的研究也显示相同体积分数的海藻酸钠溶液黏度较果胶溶液黏度要大[7]。Bekhit的研究显示，海藻酸钠与果胶的复合物比单纯的果胶和海藻酸钠更能增强凝胶珠的机械性能，凝胶珠更硬，这是由于果胶和海藻酸钠的协同效应导致，另外从分子建模来看，海藻酸钠的G区域和甲氧基化的半乳糖醛酸带可在平行的双晶阵列中相互组合[8]。另外，由表可知，包封率随着果胶的增加而增加，但随着海藻酸钠的比例减少，凝胶网状结构变得稀疏，当果胶与海藻酸钠的比例为8∶1时，包封率达到最大，而后开始减少。

2.2 氯化钙浓度对凝胶珠机械性能的影响

氯化钙浓度对凝胶珠机械性能的影响见表3。

表3 氯化钙浓度对凝胶珠机械性能的影响Table 3 Effects of calcium chloride concentration on mechanical properties of gel beads

由表3可知，随着氯化钙浓度的增大，凝胶珠的硬度不断增大，弹性则逐渐减小至最低然后保持不变。这是因为，随着氯化钙浓度的增大，有利于果胶与海藻酸之间的交联，使凝胶网络形成更致密，导致凝胶珠硬度增大。但随着氯化钙的浓度继续增大，过量的Ca2+则导致果胶与海藻酸钠聚集形成沉淀，或成为不溶性的盐类物质，并产生苦味，导致凝胶珠的口感质地变差。此结果与孔静等的研究一致[9]。另外，凝胶球的包封率随着氯化钙浓度的增加呈现增大的趋势，这可能由于，随着氯化钙的浓度的增大，交联充分，凝胶网络结构致密，使得更多的紫薯花色苷被紧紧固定在凝胶球内，这与刘敏的研究结果相似[10]。

2.3 胶凝时间对凝胶珠机械性能的影响

胶凝时间对凝胶珠机械性能的影响见表4。

表4 胶凝时间对凝胶珠机械性能的影响Table 4 Effect of gelation time on mechanical properties of gel beads

由表4可知，随着胶凝时间的增加，凝胶珠的硬度呈现增大的趋势，弹性则显著性降低，这是因为，由于时间的增大，使得果胶、海藻酸钠与钙离子之间进行充分的交联，使得凝胶珠变得更加的致密，从而导致凝胶珠的硬度增大，而弹性降低，由表4还可知，当胶凝时间从4 min增大到5 min时凝胶珠的硬度出现明显的增大趋势，而弹性无显著性变化。

2.4 果胶钙凝胶球制备条件的优化

根据以上单因素实验，选取果胶与海藻酸钠质量比、氯化钙浓度与凝胶珠胶凝时间，以形成的凝胶珠的硬度、弹性、对紫薯花色苷的包封率为指标进行正交实验，来确定制备凝胶珠的最优条件，正交实验结果见表5。

表5 正交实验结果Table 5 Result of orthogonal experiment

由表5可知，对紫薯花色苷包埋率最大的为第6组，机械性能较好的也为第6组实验制备的凝胶珠，这也与之前的单因素实验结果基本一致。弹性最大组为第1组，但此时硬度过低，果胶凝胶珠容易变形易破裂。由表5还可知，各因素中对凝胶珠硬度影响最大的为果胶与海藻酸钠质量比，对弹性和包封率两个指标影响最大为氯化钙浓度。由正交实验结果还可得出，当硬度和包封率最佳时的水平组合为果胶/海藻酸钠质量比为7∶1，氯化钙浓度为9%，胶凝时间为5 min。由pearson函数分析，正交实验结果的硬度和包封率相关系数为0.70为强正相关。即硬度越大，对紫薯花色苷的包封率就越大，由弹性数据可知，除了第1组、第8组弹性值明显高于其他组外，其他组的弹性并无显著性差异。以正交最佳水平做验证实验，得出凝胶珠包封率为
1.10 mg/mL，远高于最高的第6组(7∶1、5 min、3%)，因为最优组氯化钙浓度高于第6组，所测结果符合单因素实验所得规律。

2.5 溶胀性能实验

凝胶球的溶胀性能是应用于食品、药品等领域时需要衡量的重要因素之一。溶液环境会大大影响凝胶球的溶胀性能。本实验考察了凝胶球在不同pH溶液介质中的溶胀情况，结果见图2。

图2 不同介质中凝胶球的溶胀率Fig.2 The swelling ratio of beads in different mediums

由图2可知，凝胶球在溶液中溶胀前后直径均有明显变化，其中，在酸性和中性溶液中的溶胀比大致相同，在碱性溶液中的溶胀比大于在酸性和中性溶液中的溶胀比。在酸性和中性溶液中溶胀后的凝胶球还保持有一定弹性和硬度，在碱性溶液中的凝胶球溶胀后出现破碎脱落现象。这可能是因为在酸性溶液中带电荷的羧基数量较少，分子间斥力较低，而在碱性溶液中大量羧基基团被离子化，形成 —COO-，这些阴离子间产生静电排斥力，大量水分子进入凝胶体系中，使得凝胶球溶胀比增大，且果胶在碱性溶液中会发生皂化反应而被脱脂化[5，11-12]，从而产生破碎脱落现象。

2.6 体外缓释实验

就紫薯花色苷从凝胶球中的释放，本文模拟了胃肠道进行释放研究，结果见图3。

图3 凝胶球在模拟体外缓释中紫薯花色苷的累积释放率Fig.3 Cumulative release rate of anthocyanins from purple potato in simulated slow release in vitro

由图3可知，紫薯花色苷在胃液中累积释放量为25.02%，在肠液中累积释放量达到34.5%，在结肠液中大量释放，累积释放量为54.8%，由于模拟时间有限，可以看出凝胶球在5 h时，还未完全降解。在模拟胃液中，由于凝胶球具有多孔结构，凝胶球此时溶胀较弱也有部分紫薯花色苷释放出来，而在肠液和结肠液中，由于凝胶球的进一步溶胀和果胶酶的存在更加速了紫薯花色苷的释放[13]。实验结果表明，制备的海藻酸钠与果胶的天然复合钙凝胶珠能将紫薯花色苷定向输送至肠道，从而提高了人体对其吸收利用率。

2.7 凝胶球表面和超微结构比较

肉眼观察湿态凝胶球，其直径在0.5～0.7 cm，表面光滑，呈紫红色半透明状态。烘干后凝胶球为扁平的椭圆球状，表面光滑，呈深红色。冻干后的凝胶球为椭圆球状，表面有皱缩，呈红色。

扫描电子显微镜观察结果见图4。

图4 凝胶球在不同状态下的表征形态Fig.4 Characterization of gel spheres in different states A.湿态凝胶球；B.冻干凝胶球表面(100×)；C.冻干凝胶球切面(35×)

由图4可知，冻干后，凝胶球体积发生明显变化，表面粗糙并产生褶皱，整体为椭球形。半球切面显示，凝胶球外壳结构致密，内核有很多空洞结构，该结果说明本实验制作的凝胶球结构能用于对紫薯花色苷的包埋。

3 结论

本实验制备了海藻酸钠与果胶的复合钙凝胶球并用于对紫薯花色苷的包埋，运用单因素及正交实验分析方法探讨了果胶与海藻酸钠比例、氯化钙浓度、胶凝时间对海藻酸钠-果胶钙凝胶球的机械性能及对紫薯花色苷包埋率的影响。由单因素实验结果可知，随着果胶与海藻酸钠比例的增大、氯化钙浓度的增大，凝胶球的硬度增大，弹性则没有显著性差异，胶凝时间的延长使凝胶球的硬度增加，弹性显著性降低，评价指标中硬度与包封率为强正相关。采用正交实验进一步优化果胶-海藻酸钠凝胶球形成的条件，得出最优组：果胶与海藻酸钠比例为7∶1，氯化钙浓度9%，胶凝时间5 min。此时凝胶球硬度最大、包封率最高1.10 mg/mL。将荷载紫薯花色苷的果胶-海藻酸钠复合钙凝胶球进行溶胀、体外缓释、SEM实验，结果表明凝胶球形成的壳核结构能将紫薯花色苷包埋于其中，且能定向输送至肠道进行人体的吸收，可有效避免胃液对紫薯花色苷的消化降解，提高了紫薯花色苷在人体中的生物利用率。