EDTA抗凝血对四种试验结果的影响

黄稳妃 李春英 覃明强 谢华艳 黄永梅/广西钦州市动物疫病预防控制中心 535000

当前生猪生产受非洲猪瘟的影响、饲料价格上涨及环保升级的严峻考验，根据实际生产形势和动物防疫管理工作需要，农业农村部下发《关于加强动物疫病风险评估做好跨省调运种猪产地检疫有关工作的通知》要求严格开展动物疫病风险评估，评估内容包括区域动物疫病流行病学调查情况、种猪场防疫条件、养殖档案记录、有关疫病日常检测情况等。使用抗凝管采血可最大限度分离血清也能保证血清清澈透明，通过使用含乙二胺四乙酸（EDTA）盐的抗凝血清对三种不同动物疫病相关实验方法的结果与正常析出血清进行对比分析，讨论结果差异原因、提高检测准确率、避免误诊，对猪场疫病监测和净化有具体实用的指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验器材

纯水仪、单道、多道移液器、生化培养箱、酶标仪、量筒、试管、离心机。

1.2 血清样品

A组：猪血液样品30份，自然分离析出血清，编号备用。

B组：同一份含乙二胺四乙酸盐（EDTA）的抗凝猪血液样品30份，分离血浆，编号备用，编号顺序同非抗凝血样品。

1.3 诊断试剂口蹄疫O型液相阻断ELISA检测试剂盒购于中国农科院兰州兽医研究所诊断中心，批号：20200401101-1；

猪高致病性蓝耳病间接ELISA检测试剂盒购于韩国金诺生物公司，批号：20200203；

布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原购于青岛立见诊断技术发展中心，批号：010011905，010013201。

1.4 检测原理及方法猪O型口蹄疫抗体检测依据《口蹄疫诊断技术-液相阻断酶联免疫吸附试验操作》（GB/T 18935-2018）进行。液相阻断ELISA检测方法是使用双抗体夹心法，针对抗原分子两个不同决定簇单克隆抗体分别作为固相抗体、酶标抗体，ELISA在免疫酶技术的基础上发展的新型免疫测定方法，过程包括抗体（抗原）吸附在固定载体上这一过程称为包被，分别按顺序加待检抗原（抗体），酶标记抗体（抗原），形成抗体（抗原）加待检抗体（抗原）加酶标记抗体复合物，再加入酶底物发生有色反应，最后通过酶标仪在特定波长的光波下吸收计算抗体（抗原）的量值。

O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA，严格按试剂盒说明书进行操作。病毒抗原对照4孔，弃去最高最低OD值，计算剩余2孔OD值的平均值，即为临界值。待检样品OD值＞临界值，判定为阴性；待检样品OD值≦临界值，判定为阳性，阳性最高稀释倍数为样品效价，抗体效价大于或等于1:64为O型口蹄疫抗体阳性，1:32～1:64为可疑，小于1:32为阴性。

猪高致病性蓝耳病抗体检测依据《猪繁殖与呼吸综合征诊断方法间接酶联免疫吸附试验》（GB/T18090-2008）进行操作。间接ELISA检测方法是已知定量抗原包被在固定载体上，依次加入等检抗体与之结合（第一抗体），加入酶标抗球蛋白抗体（第二抗体）与第一抗体结合形成抗原-抗体-酶标第二抗体复合物，加入酶底物进行酶促反应，最后通过酶标仪在特定波长的光波下吸收计算抗体（抗原）的量值。

猪高致病性蓝耳病间接ELISA。严格按试剂盒说明书进行操作。样品S/P值=（样品OD值-阴性OD均值） /（阳性OD均值-阴性OD均值），S/P值≧0.4为阳性，S/P值＜0.4为阴性。

布鲁氏菌病抗体检测依据《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646-2018）进行。试管凝集试验（SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)是布鲁氏菌病检测、诊断的2种检验方法，在实际操作过程中，RBPT作为快速初筛，阳性样品再次用SAT定性确定。

2 结果与分析

结果表明，采自同一头猪的血液样品，经使用含EDTA分离血清和自然分离析出血清分别检测，EDTA对O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA，猪高致病性蓝耳病抗体间接ELISA，实验结果无明显的差异（详见表1）。ELISA是抗原抗体特异性结合酶标物反应显色试验，特异性明显，与抗体效价对应关系稳定，通过仪器设备判读结果，操作步骤虽繁多，但受客观及理化因素影响较小。

含EDTA分离血清对虎红平板凝集试验(RBPT)存在较大的差异（详见表1、2），结果显示含抗凝剂EDTA的血浆样品虎红平板凝集试验结果均为阳性，试管凝集试验为阴性；而和同一份猪血液样品自然析出血清试管凝集试验为阴性。根据实际检测过程中，虎红平板凝集试验(RBPT)作为快速初筛，阳性样品再次用试管凝集试验（SAT）定性确定，可以判定含EDTA抗凝剂的样品在虎红平板凝集试验(RBPT)中会出现严重的非特异性凝集现象，显假阳性，从而影响结果判定造成误诊。

表1 不同血清样品检测结果（+表示阳性，-表示阴性）

表2 不同血清对四种试验结果差异情况