小檗碱通过调控NLRP3炎症小体活化改善糖尿病肾功能的实验研究

田鹤　王雅光　阎文柱　穆长征

[摘要] 目的 研究小檗堿对糖尿病小鼠肾组织中NLRP3炎症小体活化的影响，探讨小檗碱保护糖尿病小鼠肾功能的作用机制。 方法 髙脂高糖饮食喂养后注射链脲佐菌素，建立糖尿病肾病小鼠模型。成模小鼠随机分为糖尿病肾病组（DN）和小檗碱治疗组（BBR），每组10只。另取10只小鼠作为正常对照组（Control）。动态检测小鼠的血糖和尿蛋白。小鼠饲养6个月后取材肾，通过HE染色观察肾组织病理变化，应用免疫组织化学技术和免疫印迹技术检测小檗碱对NLRP3表达的影响。 结果 糖尿病肾病组小鼠血糖和尿蛋白持续升高，各时间点与Control组比较均差异显著（P<0.01），4～24周，小檗碱治疗组降低血糖和尿蛋白，与DN组比较差异显著（P<0.05或P<0.01）。糖尿病肾病组小鼠肾小体肿大，肾小管上皮细胞空泡样改变，小檗碱可明显减轻高糖造成的病理损害。免疫组织化学和免疫印迹检测结果证实小檗碱抑制NLRP3的表达。 结论 小檗碱通过抑制NLRP3炎症小体的活化改善糖尿病肾病症状。

[关键词] 糖尿病肾病;小檗碱;NLRP3;炎症小体

[中图分类号] R392          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0034-04

Experimental study of berberine in improving diabetic renal function by regulating NLRP3 inflammasome activation

TIAN He   WANG Yaguang   YAN Wenzhu   MU Changzheng

School of Basic Medicine， Jinzhou Medical University， Jinzhou   121001， China

[Abstract] Objective To study the effect of berberine on the activation of NLRP3 inflammasomes in the kidney tissue of diabetic mice， and to explore the mechanism of berberine in protecting the renal function of diabetic mice. Methods A mouse model of diabetic nephropathy was established by injecting streptozotocin after high-fat high-sugar diet. The model mice were randomly divided into Diabetic nephropathy（DN） group and Berberine（BBR） group， with 10 mice in each group. Another 10 mice were taken as normal control group. The blood glucose and urine protein in mice were dynamically detected. The kidneys were taken from the mice after 6 months of rearing， and the pathological changes of the kidney tissues were observed by HE staining. The effect of berberine on the expression of NLRP3 was detected by immunohistochemistry and western blotting. Results In the DN group，the blood glucose and urine protein of mice continued to increase， and there were significant differences between the DN group and the control group at each time point（P<0.01）. 4 weeks to 24 weeks， compared with the DN group， Berberine group reduced blood glucose and urine protein （P<0.05 or P<0.01）. The renal corpuscles of diabetic mice were enlarged， and the renal tubular epithelial cells had vacuole-like changes. Berberine can significantly reduce the pathological damage caused by high glucose. The results of immunohistochemistry and western blotting confirmed that berberine inhibited the expression of NLRP3. Conclusion Berberine can improve the symptoms of diabetic nephropathy by inhibiting the activation of NLRP3 inflammasome.

[Key words] Diabetic nephropathy; Berberine; NLRP3; Inflammasome

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetes mellitus，DM）最为严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾病（End-stage renal disease，ESRD）和DM患者死亡的主要原因[1]。糖尿病肾病的发病机制至今不明，尚无有效的治疗手段。越来越多的证据表明高血糖生成的糖基化终末产物（Advanced glycation end products，AGEs）及其受体（Receptor for advanced glycation end products，RAGEs）相互作用，产生氧化应激和炎症反应，最终导致糖尿病患者肾组织结构的逐步破坏和肾功能的进行性下降[2，3]。NLRP3（NOD-like receptor family，pyrin domain containing 3，NLRP3）炎症小体参与多种肾脏疾病的发生发展，研究发现db/db糖尿病小鼠血清中IL-1β和IL-18的含量明显高于野生小鼠，同时在其肾组织中检测到NLRP3的表达显著增加[4]。

小檗碱是中药黄连的主要成分，广泛应用于心脑血管疾病及糖尿病等慢性病的治疗，具有降血糖、抗炎以及清除氧化应激产物等作用。但是小檗碱是否影响糖尿病肾组织中的NLRP3炎症小体的活化，报道较少。为此，本研究通过建立糖尿病肾病小鼠模型，应用HE染色、免疫组织化学染色和免疫印迹技术检测小檗碱对糖尿病小鼠肾组织形态功能的影响及对NLRP3炎症小体表达的影响，从而验证小檗碱通过抑制NLRP3炎症小体活化进而改善糖尿病肾病的实验假说，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57小鼠，雄性，30只，购于北京维通利华实验动物中心[SCXK（京）2016-0006]，饲养于锦州医科大学实验动物中心。

1.2 實验试剂

链脲佐菌素粉末（Sigma公司S0130）;NLRP3单克隆抗体（Sigma公司HPA012878）;免疫组化试剂盒（北京中杉金桥公司SAP9100）、DAB显色试剂（北京中杉金桥公司ZLI9017）;PVDF膜（碧云天公司FFP24）;ECL发光液（碧云天公司P0018AS）。

1.3 糖尿病肾病模型建立及分组

高糖高脂饮食喂养C57小鼠1个月，禁食12 h，腹腔注射1%STZ溶液（55 mg/kg），间隔1 d再次注射。STZ以0.5 mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制，现用现配。小鼠代谢笼内喂养。若血糖值>16.7 mmol/L，尿量﹥原尿量150%，尿蛋白>30 mg/（kg·24 h），则小鼠符合糖尿病肾病模型标准[5]。成模的小鼠随机分为糖尿病肾病组（DN）及小檗碱治疗组（BBR），随时补充死亡的小鼠，保证每组10只小鼠纳入统计分析。另设10只小鼠为正常对照组（Control）。BBR组小鼠灌胃给药，给药剂量为0.1 g/kg，间隔24 h灌胃一次。C组和DN组小鼠给予等体积的蒸馏水。观察动物的一般状态，每2周检测一次血糖和尿蛋白。

1.4 HE染色

每组取5只小鼠，3%戊巴比妥钠麻醉，4%多聚甲醛灌流固定，剖腹取肾脏，4%多聚甲醛固定48 h，流水冲洗3 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片机切片，厚度5 μm。60℃烤片1 h，切片脱蜡至水，苏木素浸泡5 min，盐酸酒精分色，流水冲洗20 min，伊红染液染色4 min，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，光学树胶封片，拍照。

1.5 免疫组织化学染色

切片脱蜡至水，清除内源性过氧化物酶活性（3%H2O2浸泡10 min），高压热修复（修复液为柠檬酸盐缓冲液）2 min 30 s，自然冷却至室温，滴加NLRP3抗体（兔抗小鼠，1：500），湿盒内4℃过夜。室温放置1 h，滴加生物素标记的羊抗兔IgG，室温10 min，PBS洗涤5 min，3次。滴加辣根酶标记的链酶素工作液，室温10 min，PBS洗5 min，3次。DAB显色，双蒸水终止。苏木素复染5 min，盐酸酒精分色1 s，流水冲洗，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，光镜观察拍照。

1.6 免疫印迹

每组5只小鼠，麻醉后迅速剥离肾脏，-80℃冻存。冻存的肾组织，超声波粉碎匀浆，加入3倍体积蛋白裂解液，4℃摇床裂解30 min。提取上清（高速离心），测上清液蛋白浓度，根据浓度制备样品。SDS-PAGE凝胶电泳，槽式湿转方式转膜。TBST洗膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入配置好的NLRP3抗体（1：500），放入层析冷柜，4℃16 h。TBST洗膜3次，加入二抗（羊抗兔，1：3000）室温孵育2 h，TBST洗膜后ECL发光法显色，以GAPDH作为内参，采集图像，分析光密度值，计算蛋白表达。

1.7 观察指标

实验过程中观察动物的一般状态，每2周检测一次血糖和尿蛋白。剪鼠尾获得血液，滴到血糖试纸上，应用血糖仪检测血糖。测尿蛋白前将小鼠放入代谢笼饲养，收集24 h尿液，应用比色法检测尿蛋白浓度。

1.8 统计学分析

应用SPSS18.0统计学软件分析实验数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间用单因素方差分析，两两比较应用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小檗碱调控糖尿病小鼠的血糖和肾功能

随着病程的加长，糖尿病肾病组小鼠血糖值逐渐升高，8 h、12 h、16 h、20 h、24 h小檗碱治疗组小鼠的血糖值明显低于同时间的糖尿病肾病组，正常对照组小鼠血糖值无明显改变（表1）。每2周收集一次24 h尿液，测尿蛋白数值，检测小檗碱对糖尿病肾组织尿蛋白排出情况的影响。与对照组比较，糖尿病肾病组小鼠尿蛋白显著升高。与糖尿病肾病组比较，小檗碱对高糖导致的尿蛋白增加有降低作用。见表2。

2.2 小檗碱减轻糖尿病小鼠肾组织病理损伤

通过HE染色观察小檗碱对糖尿病肾组织病理变化的影响。结果显示：正常对照组小鼠肾小体结构完整，肾小囊腔清晰可见，无增生等病变，肾小管单层立方形上皮围成，管腔规则。糖尿病肾病组小鼠肾小体体积增大，肾小囊腔缩小，肾小管上皮细胞染色变浅，基底膜增厚。小檗碱治疗组小鼠肾小体轻度增大，肾小囊腔与对照组无明显变化，病变范围比糖尿病肾病组小且轻（封三图4）。

2.3 小檗碱抑制糖尿病小鼠肾组织中NLRP3的表达

通过免疫组织化学染色和Western blot技术检测小檗碱对糖尿病小鼠肾组织中NLRP3蛋白表达和含量的影响，结果显示：正常对照组小鼠肾组织中NLRP3的表达较弱，糖尿病肾病组小鼠肾脏中NLRP3表达较强，小檗碱治疗组小鼠肾组织中NLRP3的表达与糖尿病肾病组相比明显减弱（封三图5、图1）。

3 讨论

糖尿病肾病（DN）是一种由于长期高血糖引发的微血管并发症，发病率呈现逐年增高的趋势，患者自身生活质量下降，而且给家庭和社会带来沉重的负担。DN的发病机制至今不明，主要病理表现为肾小球肥大，系膜基质合成增加，降解减少，系膜区变宽或结节形成，基底膜增厚，随着病程的进展，逐步发展为肾小球硬化和肾小管间质纤维化[6，7]。2002年，Tschopp首先提出了炎症小体的概念，随后，人们相继发现了NLRP1、AIM2、NLRP3、NLRC4等炎症小体[8，9]。在这些炎症小体中，对NLRP3的研究最为广泛。NLRP3在静息状态下无活性，当细胞受到某种刺激后，NLRP3与凋亡相关微粒蛋白（ASC）结合，招募pro-caspase-1形成复合体，使其成为有生物活性的caspase-1，即白细胞介素-1β （interleukin，IL-1β）转化酶，后者作用于炎症因子前体如pro-IL-18等，产生具有致炎活性的IL-18，参与机体天然免疫应答及细胞损伤[10]。研究报道，炎症小体NLRP3参与多种肾脏疾病的发生发展，如糖尿病腎病、肾脏纤维化、足细胞损伤等[11]。靶向NLRP3通路对糖尿病和糖尿病肾病的治疗具有一定的作用。

小檗碱是中药黄连的有效成分，除了具有抑制炎症反应的作用，还可降低血糖和血脂。学者们对小檗碱治疗糖尿病的机制进行大量的研究，文献报道小檗碱能够增强脂肪细胞和骨骼肌对糖的摄取和消耗，增加肝脏和肌组织胰岛素受体的表达[12，13]。小檗碱还具有增加肝脏低密度脂蛋白的作用，从而降低血清中的胆固醇和血糖。研究发现，小檗碱可以阻止T淋巴细胞的分化和巨噬细胞的游走，从而减轻促炎症因子的释放。在糖尿病肾病的治疗中，小檗碱也有显著的疗效，能够减轻糖尿病肾病的病理进程，保护肾小球足细胞免受损伤，维持滤过屏障的完整[14]。

文献报道，炎症反应与糖尿病并发症的发生发展关系密切，长期的高血糖会导致NLRP3炎症小体的活化，活化的NLRP3激活caspase-1等凋亡蛋白，诱导肾小管上皮细胞或足细胞凋亡[15，16]。小檗碱具有降糖降脂的作用，广泛应用于糖尿病的治疗，小檗碱是否与糖尿病肾组织中炎症小体的活化有关，报道较少。为此，本研究从炎症小体角度探索小檗碱的作用机制。推测小檗碱通过抑制NLRP3炎症小体的活化，降低炎症反应，减轻细胞凋亡损伤，从而改善糖尿病肾病症状。为了验证这一假说，本课题组选择C57小鼠为实验动物，先以高脂高糖饮食喂养，再小剂量注射STZ破坏胰岛细胞，制备了2型糖尿病肾病模型。小檗碱采用灌胃的方式给药。实验发现小檗碱不仅降低血糖，而且降低尿蛋白，明显改善肾功能。HE染色是观察肾组织形态变化的经典方法，染色结果显示，长期高糖，小鼠肾小体肿大，肾小管上皮细胞空泡变性，小檗碱能够减轻这些病理损伤。免疫组化和免疫印迹结果证实高糖诱导NLRP3的表达，而小檗碱显著抑制NLRP3表达。

综上，本研究证实了小檗碱具有降低血糖、减少尿蛋白，改善糖尿病肾病症状的作用。小檗碱通过抑制NLRP3炎症小体的活化改善糖尿病肾功能。在后续的实验中，还将对NLRP3下游蛋白和细胞因子的变化进行深入研究，进一步揭示小檗碱的作用机制。

[参考文献]

[1] Umanath K，Lewis JB. Update on diabetic nephropathy：Core curriculum 2018[J]. Am J Kidney Dis，2018，71（6）：884-895.

[2] Bao L，Li J，Zha D，et al. Chlorogenic acid prevents diabetic nephropathy by inhibiting oxidative stress and inflammation through modulation of the Nrf2/HO-1 and NF-κB pathways[J]. Int Immunopharmacol，2018，54：245-253.

[3] Luan P，Zhuang J，Zou J，et al. NLRC5 deficiency ameliorates diabetic nephropathy through alleviating inflammation[J]. FASEB J，2018，32（2）：1070-1084.

[4] Giuliani KTK，Kassianos AJ，Healy H，et al. Pigment nephropathy：Novel insights into inflammasome-mediated pathogenesis[J]. Int J Mol Sci，2019，20（8）：1997.

[5] Malte K？觟lling，Tamas Kaucsar，Celina Schauerte，et al. Therapeutic miR-21 silencing ameliorates diabetic kidney disease in mice[J]. Mol Ther，2017，25（1）：165-180.

[6] Nagib AM，Elsayed Matter Y，Gheith OA，et al. Diabetic nephropathy following posttransplant diabetes mellitus[J]. Exp Clin Transplant，2019，17（2）：138-146.

[7] Bhadauria D，Chellappan A，Kaul A，et al. Idiopathic membranousnephropathyin patients with diabetes mellitus：A diagnostic and therapeutic quandary[J]. Clin Kidney J，2018，11（1）：46-50.

[8] Guo Q，Wu Y，Hou Y，et al. Cytokine secretion and pyroptosis of thyroid follicular cells mediated by enhanced NLRP3，NLRP1，NLRC4，and AIM2 inflammasomes are associated with autoimmune thyroiditis[J]. Front Immunol，2018，9：1197.

[9] Liang F，Zhang F，Zhang L，et al. The advances in pyroptosis initiated by inflammasome in inflammatory and immune diseases[J]. Inflamm Res，2020，69（2）：159-166.

[10] Sano S，Oshima K，Wang Y，et al.Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome[J]. J Am Coll Cardiol， 2018，71（8）：875-886.

[11] Shi Y，Huang C，Zhao Y，et al. RIPK3 blockade attenuates tubulointerstitial fibrosis in a mouse model of diabetic nephropathy[J]. Sci Rep，2020，10（1）：10458.

[12] Li Y，Wang B，Shen J，et al. Berberine attenuates fructose-induced insulin resistance by stimulating the hepatic LKB1/AMPK/PGC1α pathway in mice[J]. Pharm Biol，2020，58（1）： 385-392.

[13] El-Zeftawy M，Ghareeb D，ElBealy ER，et al. Berberine chloride ameliorated PI3K/Akt-p/SIRT-1/PTEN signaling pathway in insulin resistance syndrome induced in rats[J]. J Food Biochem，2019，43（12）：e13049.

[14] Qin X，Jiang M，Zhao Y，et al. Berberine protects against diabetic kidney disease via promoting PGC-1α-regulated mitochondrial energy homeostasis[J]. Br J Pharmacol，2019， online.

[15] An X，Zhang Y，Cao Y，et al. Punicalagin protects diabetic nephropathy by inhibiting pyroptosis based on TXNIP/NLRP3 pathway[J]. Nutrients，2020，12（5）：1516.

[16] Ding S，Xu S，Ma Y，et al. Modulatory mechanisms of the NLRP3 inflammasomes in diabetes[J]. Biomolecules，2019， 9（12）：850.

（收稿日期：2020-04-23）

[基金項目] 辽宁省自然科学基金项目（20170540341、20170540393、20180550649）;辽宁省教育厅青年科技人才“育苗”项目（JYTQN201917）

通讯作者