变构药物先导化合物
——从偶然发现到合理设计

张健

（上海交通大学医学院，上海 200025）

变构效应（allosteric effect）是一种精确调节生物大分子功能的机制，指大部分为蛋白质的生物大分子在远离底物位点或功能位点的其他区域存在变构位点，这些位点通过传递配体结合等作用来造成大分子活性改变的过程。从20世纪初对血红蛋白的玻尔效应研究开始，到上世纪60年代由Monod和Jacob教授首次提出变构效应这一概念，再到目前美国FDA批准的多个变构药物上市，变构效应及其在药物设计中的应用正越来越得到研究者的关注，变构效应更是被称为“生命的第二秘密”。

变构药物设计的核心在于发现变构位点与合理设计变构调节剂，从而通过间接的方式调节靶标蛋白活性。相比于靶向蛋白功能位点的正构药物来说，变构药物具有一系列天然优势：其一，变构位点理论上可以位于蛋白表面的任何位置，比起长期进化选择后的蛋白功能位点，变构位点保守性更低，从而变构调节剂具有更好的亚型选择性和更低的副作用，具有临床应用价值；其二，当底物和目标蛋白结合能力较强或者涉及口袋平坦宽大的蛋白-蛋白相互作用时，很难开发直接靶向底物位点的药物分子，而变构调节剂因并不直接结合在底物位点，此时依然可以调控蛋白活性；其三，变构调节剂可以和正构位点的分子共同作用，对蛋白活性进行更加精细和复杂的调节，在精准医学领域具有应用可能；其四，由于变构调节剂对特定构象的结合，只有在正构小分子存在时，变构调节剂才会对蛋白活性进行调节，这不仅进一步减少了副作用，也有利于组织特异性给药途径的探索。近10年来，变构小分子数量的激增也证明了变构效应在药物设计领域受到极大重视。

基于Sirtuin 6（SIRT6）的变构激动剂设计是合理变构药物设计的一个典型范例。SIRT6是一种组氨酸去乙酰化酶，其功能是将乙酰化赖氨酸侧链的乙酰基转移到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）上，在抗炎、DNA衰老修复和肿瘤控制中起到重要的作用。研究发现，SIRT6过表达的小鼠明显更加长寿，且癌细胞更快凋亡，而对正常细胞没有影响。因此，SIRT6激动剂的发现可能具有重要的临床意义。然而，传统靶向正构位点的药物设计策略很难达到激动效果。针对酶激动的难靶问题，变构方法则可以大显身手。笔者课题组采用自主开发的Allosite变构位点识别方法，预测了潜在的SIRT6正构位点背侧的变构位点。在虚拟筛选超过500万个化合物后，基于变构调节剂的打分原则和实验验证，成功获得了EC50在200 μmol· L-1左右的2个化合物，并通过基于结构的药物设计方法将EC50优化到5 μmol· L-1。小分子和SIRT6蛋白的共晶表明，Allosite有效识别了具有激动活性的变构位点，细胞和动物模型实验也验证了激动剂的抗肝癌效果。这项研究不仅为靶向SIRT6蛋白的药物设计提供了良好的先导化合物，促进了对其机制的研究，也为其他酶激动剂的变构设计提供了成功范例。

变构药物设计因其巨大价值在引起世界各国科研机构和药物研发公司重视的同时，也面临着诸多挑战，主要包括以下几点：1）有价值的变构位点发现困难。正构配体通常结合在明显而保守的正构位点，而理论上，除了正构位点之外的任何位置都可能成为变构位点，这造成了变构位点确定的困难，同时也难以测定变构位点与正构位点间的作用偶联。2）变构耐药突变容易发生。由于变构位点进化压力小，变构位点更容易发生突变，从而造成变构调节剂失效，另外由于变构效应涉及蛋白内信号通路，通路上的突变也会造成变构效应的变化。3）变构效应具有种属特异性。对人源蛋白有效的变构调节剂对于鼠源蛋白可能就会失效，这对于药物设计的实验检验步骤较为不利。4）变构调节剂与蛋白的共晶复合物不易获得。通常变构调节剂与蛋白结合力不如正构调节剂，构效关系不易追溯，同时具有较低的水溶性，因此难以获得调节剂-蛋白共晶结构，从而影响了临床实验的进行。

作为生命科学、医学和化学的交叉领域，变构药物设计在目前投入大、风险高的新药发现领域是一个不可忽视的新方向。近年来，在综合运用实验手段和计算机辅助药物设计方法的基础上，变构领域的方法学研究已取得了一系列进展，对变构药物设计的蓬勃发展起到了助推作用。在变构数据库方面，AlloSteric Database（ASD）和ASBench等高质量数据资源对位点预测起到了重要作用；在变构位点发现方面，Allosite、Corrsite、PARS等方法从变构位点的不同性质出发进行预测，为研究者们寻找变构位点提供了极大的便利；在变构信号传递和突变分析方面，AlloDriver、AlloSigMA、MCPath等方法对变构效应的机制探究做出了一定的贡献，也促进了变构先导化合物的优化；在变构调节剂打分和预测方面，Alloscore可用于结合活性预测，AlloFinder和CovCys等可用于自动化变构分子探测，均已经在变构药物设计领域有所建树。从实验角度出发，X射线衍射和冷冻电镜技术的发展提供了更多可用于变构药物设计的生物大分子结构，核磁共振波谱法也对于变构调节剂的机制研究和辅助结构测定有着很大帮助。近年来，双电子-电子共振光谱法、氢氘交换质谱法等方法的发展也在变构效应验证和探索中发挥了作用。基于变构研究方法快速发展，变构调节剂发现逐渐规范化、流程化的事实，变构药物已经从偶然发现进入到基于结构的合理药物设计这一阶段。

随着变构药物设计进入新阶段，一些曾经难成药的蛋白已经陆续有了靶向性的变构调节剂，我国科研人员在变构效应开发方面也有了初步的成效。以蛋白酪氨酸激酶SHP2变构抑制剂设计为例，研究者没有选择难以靶向的高度保守且带正电的催化位点进行药物设计，而是基于变构位点，试图通过变构抑制剂将蛋白稳定在自抑制构象来发挥抗肿瘤效果。研究者首先针对常见致病突变E76A进行了20 000个化合物的生化筛选，获得了对E76A突变体特异性有效，但对正常SHP2无效的化合物，并通过构效关系进一步优化，获得了优化后的化合物和蛋白的共晶结构。从结构提示的重要相互作用出发，研究者进一步优化了小分子调节剂，将其IC50控制在0.7 μmol· L-1，选择性提高到了30倍左右。最终的化合物在分子水平能够抑制下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等过程，在细胞水平也能发挥广谱的抗癌作用。该SHP2的变构抑制剂对于开发新的癌症疗法有所裨益。近期，新发现的针对磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）的变构抑制剂对非小细胞肺癌的控制效果也值得关注。以之前变构抑制剂的共晶结构为基础，研究者通过调节磺酰胺的位置，控制了抑制剂和底物的竞争作用，最后成功开发了HKB99作为PGAM1的抑制剂。该抑制剂不仅可以负向调控3-磷酸甘油酸向2-磷酸甘油酸的转化，抑制肿瘤代谢和温伯格效应，也可以削弱PGAM1和α-平滑肌肌动蛋白的相互作用，从而抑制癌细胞生长和转移，还可以通过活性氧依赖的c-Jun氨基末端激酶（JNK/c-Jun）信号通路引发癌细胞凋亡。总体上高效控制了非小细胞肺癌的生长和转移，对未来变构药物设计也提供了一定参考。在变构激动剂方面，α7型尼古丁乙酰胆碱受体（α7nAChR）的变构调节剂开发可以提供较好的范例。α7nAChR的激动有利于诸如精神分裂症、阿尔茨海默病等神经精神疾病的控制，由于神经系统中有多个该蛋白的其他亚型，设计高选择性的变构激动剂的需求度很高。从已知2-乙基硫烷基-5-氨基噻唑结构出发，研究者首先合成了一个小的化合物库，并筛选其激动活性，对激动活性较好的化合物做不同修饰，之后基于构效关系进一步优化结合效力和选择性最好的一类化合物。最终成功设计了化合物JWX-A1223a作为α7nAChR的选择性激动剂，同时揭示N6-（2-氯-6-甲基）-苯基是重要的活性基团，为之后的药物设计铺平了道路。总的来说，变构调节剂设计可以在肿瘤控制、神经疾病治疗等方面提供新策略，而合理变构药物设计是推动这部分研究不可或缺的力量。

总之，经过百余年的发展，变构调节剂发现从“雾里看花”的随机猜测和偶然发现，逐渐进入了基于结构的合理设计这一阶段。借助日新月异的实验方法和计算手段，研究人员已经逐渐掌握了变构效应的有关规律。作为药物设计领域的一片蓝海，变构效应必将吸引更多的科研工作者，最终将为人类健康事业做出应有的贡献。