miR-429和Bmi-1 mRNA在肺癌组织中的表达及其临床意义

邵俊国，焦文静，王雪晓，张金艳，马 鸣，

(1．河北医科大学第四医院检验科，河北石家庄 050011；2．河北医科大学第四医院肿瘤免疫科，河北 石家庄 050011)

肺癌(lung carcinoma，LC)是我国乃至世界范围内最常见的呼吸系统恶性肿瘤，据世界癌症统计报告，2015 年我国有超过73 万新发病例，死亡病例超过60万，其病理类型主要分为非小细胞癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)和小细胞癌(small-cell lung carcinoma，SCLC)两大类，其中NSCLC 约占所有患者的85%[1]。由于肺癌进展较快，大部分患者就诊时已处于中晚期，失去了手术机会，肿瘤的耐药、转移与复发是导致患者治疗失败与死亡的重要原因，寻找与临床疗效及预后密切相关的有效预测靶点是目前科研工作者关注的热点问题之一。

微RNA(microRNAs，miRNA)在各种肿瘤中的表达及其功能研究受到国内外学者广泛关注，其极有可能成为肿瘤靶向治疗的潜在靶点和标志物。miR-429 属miR-200 家族成员，是具有广泛抗肿瘤活性的microRNA，它在肝癌、结肠癌及胃癌等多种恶性肿瘤中可通过调控肿瘤细胞增殖、侵袭转移和肿瘤多药耐药性的发生，影响肿瘤的发生、进展[2]。B 细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点-1(B-cellspecific Moloney murine leukemia virus integration site-1，Bmi-1)是一类重要的转录抑制基因，在促进肿瘤细胞放、化疗抵抗方面具有重要作用，多种肿瘤组织中Bmi-1的表达水平均呈明显升高的状态，过表达的Bmi-1可通过介导肿瘤细胞DNA损伤修复和增加肿瘤细胞表达MDR相关蛋白等机制促进肿瘤细胞对放射线和化疗药物的抵抗作用[2-3]。我们前期研究发现[4]，食管癌肿瘤组织中高表达miR-429 和低表达Bmi-1 蛋白的患者往往瘤组织较小、患者临床分期较早，同时患者5 年生存率较高，提示检测瘤组织中miR-429 及Bmi-1 蛋白的表达水平可作为标志物在监测食管癌患者临床进展及预后方面具有重要作用。这使我们联想到，在肺癌组织中，miR-429 及Bmi-1 mRNA 检测是否具有同样的意义？基于此，本课题分析了60例肺癌患者瘤组织中miR-429及Bmi-1 mRNA的表达水平及其与患者临床进展和预后之间的关系，为其作为标志物应用于肺癌临床进展及治疗监测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 LC组织的收集及患者资料

60 例肺癌组织及癌旁组织(距肿瘤边缘≥5cm，经病理证实不含癌组织)，取自2013年1—12月在河北医科大学第四医院就诊的LC 患者，其中，男性34 例，女性26例，中位年龄为65岁(40～86岁)，其中11例患者病理类型为SCLC，49 例患者为NSCLC；所有患者均按照国际抗癌联盟(UICC)标准(第7版)进行临床TNM分期，所有患者均经病理检测确诊且术前均未接受放、化疗，并签署知情同意书。本研究已经河北医科大学第四医院医学伦理委员会批准。所有患者术中组织标本均快速冻存于-80 ℃低温冰箱。

1.2 实验试剂

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)试剂盒，购自美国Thermo 公司；Trizol 试剂及RNA 提取试剂盒均购自Solarbio 公司；miR-429 及Bmi-1引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 实时荧光定量PCR 法检测患者瘤组织中miR-429及Bmi-1 mRNA表达水平

取患者LC 组织或癌旁组织，常规两步法提取细胞总RNA，miR-429 及Bmi-1 扩增引物序列由上海生工设计，序列如下：miR-429，上游5′-GCGAGGGT AATACTGTCTGGT-3′，下游 5′-CACTTCCTCAGCAC TTGTTCGTAT-3′；U6，上游 5′-GCTTCGGCAGCACA TATACTAAAAT-3′，下游 5′-CGCTTCACGAATTTGC GTGTCAT-3′；Bmi-1，上游 5′-AAATGCTGGAGAAC TGGAAAG-3′，下游 5′-AACTGTGGATGAGGAGACT G-3′。参考试剂盒说明书进行qPCR 分析。PCR 反应条件：95 ℃、5 min；95 ℃、15 s、60 ℃、30 s、72 ℃、30 s，共40个循环。miR-429及Bmi-1 mRNA的表达水平以 2-ΔΔCT值表示，其具体计算方式参考文献[4]。

1.4 LC患者瘤组织中miR-429及Bmi-1 mRNA表达水平与患者临床特征、病情进展及预后之间的关系分析

根据方法 2.1 中LC 组织中 miR-429 及 Bmi-1 mRNA 的表达水平，计算 60 例患者 2-ΔΔCT值的均值，LC 组织中miRNA-429 及Bmi-1 的表达水平分为高表达组(≥均值水平)和低表达组(＜均值水平)，分析miR-429 或Bmi-1 高表达组与低表达组患者年龄、性别、瘤组织大小、患者临床分期、病理类型、是否有淋巴结转移及患者总生存期(overall survival time，OS)之间的差异。OS定义为手术开始至患者死亡或随访截止的时间，随访截止时间为2018年6月。

1.5 统计学方法

所有数据采用SPSS13.0 统计学软件进行统计分析，实验结果以xˉ±s表示，所有实验均独立重复3次，分析LC组织与相应的癌旁组织中miR-429表达差异采用配对t检验，miR-429 表达与LC 患者临床病理指标间的关系采用χ2检验，miR-429 与Bmi-1 表达间的关系采用Spearman 秩相关性检验，采用Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线，患者生存率比较采用logrank 法，影响患者预后的多因素分析采用Cox 回归分析，两独立样本间的比较采用t检验。以α=0.05 为检验水准。

2 结 果

2.1 miR-429 及 Bmi-1 在 ESCC 组织中的表达水平及其与患者临床病理指标及患者生存期之间的关系

采用qPCR检测LC组织及对应的癌旁组织中miR-429 及Bmi-1 mRNA 的表达水平，结果如图1 所示，可见NSCLC 及SCLC 组织中miR-429 表达水平均较癌旁组织明显减低，而Bmi-1 mRNA表达水平则均较癌旁组织明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)；但NSCLC 与 SCLC 组织中 miR-429 及 Bmi-1 mRNA 表达水平均无明显差异(P＞0.05)。Spearman 秩相关性检验分析结果显示，LC组织中miR-429和Bmi-1的表达水平呈明显负相关(r=-0.463 2，P＜0.01)。

图1 miR-429及Bmi-1在LC组织中的表达水平及二者相关性分析

2.2 LC 组织中 miRNA-429 与 Bmi-1 表达水平与患者临床病理指标之间的关系

以上述60 例LC 患者肿瘤组织中miR-429 的平均相对表达水平0.51 为临界阈值，将60 例LC 患者分为miR-429 高表达组和低表达组，其中miR-429 高表达者29例，低表达者31例。同时，以Bmi-1的平均相对表达水平1.53 为临界阈值，将LC 患者瘤组织分为Bmi-1高表达和低表达组。χ2检验分析结果见表1及表2，LC 组织中高表达与低表达miR-429 及Bmi-1 的患者性别、年龄及病理类型均无明显差异(P＞0.05)，而患者瘤组织大小、临床分期、是否有淋巴结转移有明显差异(P＜0.05)。LC 组织中 miR-429 呈低表达而Bmi-1 呈高表达的患者往往瘤组织较大、临床分期较晚、更易发生淋巴结转移。

表1 LC组织中miR-429表达水平与LC患者临床病理指标之间的关系

2.3 LC 组织中 miRNA-429 与 Bmi-1 表达水平对患者预后的影响

Log-rank分析结果见图2，显示瘤组织中miR-429低表达的患者，5年生存率为13.79%，明显低于miR-429高表达的患者(41.93%，P＜0.01)。同时，瘤组织中Bmi-1 高表达的患者，5 年生存率为15.63%，明显低于Bmi-1低表达的患者(42.86%，P＜0.05)。

表2 LC组织中Bmi-1 mRNA 表达水平与LC患者临床病理指标之间的关系

2.4 影响LC患者预后因素分析

单因素分析结果见表3，LC 患者临床分期、是否淋巴结转移、miR-429 及Bmi-1 的表达水平均与患者OS 有关(P＜0.05)，而本组中患者性别、年龄、瘤组织大小及病理类型均与5 年生存率无显著相关(P＞0.05)。Cox 回归多因素结果见表4，LC 患者临床分期、是否淋巴结转移、miR-429及Bmi-1的表达水平是影响LC患者预后的独立因素(P＜0.05)。

3 讨 论

图2 miR-429及Bmi-1表达水平与LC患者预后之间的差异分析

表3 影响LC患者预后的单因素分析

表4 影响LC患者预后的多因素分析

MiR-429 属miR-200 家族成员，近年来，关于其调控肿瘤细胞生长的作用受到广泛关注[6-7]。Bmi-1 是一类重要的转录抑制基因，其可通过结合于靶基因的启动子区，抑制靶基因的表达，在促进胚胎干细胞的增殖及自我更新中具有重要作用[8-9]。同时，近年来我们的研究结果及文献[10-12]报道均显示，Bmi-1在促进肿瘤细胞放、化疗抵抗方面具有重要作用，多种肿瘤组织中Bmi-1的表达水平均呈明显增高的状态，过表达的Bmi-1可通过促进肿瘤细胞对放射线和化疗药物的抵抗作用，促进患者病情进展，进而影响患者临床疗效和预后。

但miR-429及Bmi-1在LC组织中的表达及其临床意义目前研究仍较少。基于此，我们通过qPCR 技术检测了60 例LC 患者肿瘤组织中miR-429 及Bmi-1 mRNA 的表达水平，并分析了二者与患者临床病理特征和预后的相关性，结果发现，LC组织中miR-429表达水平较癌旁组织明显降低，而Bmi-1表达水平较癌旁组织明显升高。LC组织中miR-429低表达而Bmi-1高表达的患者往往瘤组织较大、临床分期较晚、更易发生淋巴结转移，同时患者5 年生存率较低。这提示，组织中低表达miR-429 和高表达Bmi-1 可能是肺癌临床进展和预后较差的预测性指标。这与我们前期在食管癌及弥漫大B 细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)组织中的研究结果是一致的[4，13]，提示miR-429 及Bmi-1 作为肿瘤标志物，其临床意义在不同肿瘤中可能具有一定普遍性。Cox回归多因素分析结果也显示，LC 患者临床分期、是否淋巴结转移、miR-429及Bmi-1的表达水平是影响LC患者预后的独立因素。这与我们前期研究及文献[4，7]报道，miR-429 及Bmi-1 的表达可影响多种肿瘤细胞增殖、侵袭及放化疗敏感性的结论是一致的，瘤组织中miR-429及Bmi-1的联合检测在LC中，具有预测患者临床进展和预后的作用。

我们也发现，LC组织中miR-429和Bmi-1 mRNA的表达水平呈明显负相关，提示在LC 中miR-429 与Bmi-1 的表达可能呈一定的负调控作用。与靶基因3′端非翻译区(untranslated region，UTR)相互结合，降解靶基因mRNA 或抑制靶基因mRNA 的表达，是microRNAs 发挥转录后调控作用的主要机制[14]。我们在前期研究中，通过TargetScan 数据库进行了预测，结果发现Bmi-1 可能是miR-429 下游作用的靶基因。双荧光素酶报告基因分析结果也显示，共转染miR-429 和Bmi-1 荧光质粒的293T 细胞，其荧光素酶活性明显下降，这进一步验证了我们的假设[4]。同时，鉴于Bmi-1在多种肿瘤细胞中影响DNA损伤修复过程及肿瘤耐药相关蛋白表达等方面的重要作用，我们的结果也提示miR-429/Bmi-1 轴可能在调控肺癌细胞放化疗敏感性方面具有重要作用，组织中miR-429 和Bmi-1 表达水平的联合检测具有成为肺癌临床疗效及预后监测指标的潜力，因此，二者具有成为肺癌肿瘤标记物应用于临床的潜力。

综上所述，我们发现瘤组织中miR-429 及Bmi-1的表达水平与LC 患者临床进展及预后密切相关，二者联合检测对于LC 临床疗效监测具有一定意义，因此，在未来LC临床综合诊疗中具有广泛的应用前景。