生物标志物的联合检测对矽肺早期辅助诊断的价值

徐海明，刘科良，郝艳星，汪 岭，刘志宏，德小明

(宁夏医科大学公共卫生与管理学院，职业卫生与环境卫生学系，宁夏 银川 750004)

矽肺是在生产过程中长期吸入游离二氧化硅(SiO2)粉尘而引起的以硅结节形成及弥漫性肺间质纤维化为主要病变的职业病，是尘肺中进展最快、危害最严重的一种[1-2]。目前，对矽肺的发生和发展机制并不十分清楚，公认的矽肺发病机制有机械刺激学说、化学中毒学说、硅酸聚合学说和免疫学说等[3-4]。众多学者研究发现，效应细胞释放的多种生物活性物质尤其是细胞因子在矽肺的发生发展过程中发挥着重要的作用[5]。

多项研究表明，多种因子的联合诊断效能优于单个因子的诊断效能[6-8]。因此，本研究同时测定了与矽肺发生发展进程密切相关的多个指标，包括氧化应激指标超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。随后，在统计分析的基础上，绘制受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，ROC)，并建立Logistic 回归模型，探讨联合检测多个指标应用于矽肺早期辅助诊断的灵敏度和特异性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用立意抽样法，选取在宁夏某职业病防治医院接受治疗的 65 例矽肺患者(矽肺 I 期 43 例，II 期 22 例)为病例组，以长期吸入游离SiO2粉尘的70例在岗作业人员为对照组，对照组均未被诊断为矽肺。诊断标准为《GBZ 70-2015 职业性尘肺病的诊断》。研究对象纳入标准如下：①均有确切的粉尘接触史和职业史；②矽肺患者无罹患除矽肺外的重大肺部疾病；③对照组作业人员无罹患重大肺部疾病。本研究得到了宁夏医科大学医学伦理委员会批准并获得所有研究对象的知情同意。

1.2 血样采集

用分离胶/促凝剂真空采血管采集空腹静脉血5 mL，待血清充分分离后，将血清转移至1.5 mL 离心管中，立即放入-80 ℃低温冰箱保存备用。

1.3 SOD、MDA、IL-6及TNF-α水平的测定

使用SOD 和MDA 比色试剂盒(北京华英生物技术研究所)测定研究对象血清中SOD 和MDA 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，SOD和MDA的测定波长分别为405 和532 nm(A6 半自动生化仪，北京松上公司)。使用IL-6 和TNF-α酶联免疫试剂盒(北京华英生物技术研究所)测定研究对象血清中IL-6 和TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，IL-6和TNF-α的测定波长均为450 nm(STAX FAX 2100 全自动酶联免疫分析仪，美国Awareness Technology 公司)。使用Bradford 蛋白质定量试剂盒测定研究对象血清中总蛋白水平(北京天根生化科技有限公司)。

1.4 数据统计分析

应用SPSS 22.0 软件，计量资料经正态性检验符合正态分布者采用xˉ±s描述，不符合正态分布者采用中位数和第25、75百分位数[M(P25，P75)]描述。均数比较采用协方差分析，百分位数比较采用Mann WhitneyU检验。采用GraphPad Prism 5 软件制作ROC曲线。用差异有统计学意义的血清生物标志物建立联合应用模型，采用二分类Logistic回归模型逐步回归法(引入临界值0.05，剔除临界值0.1)对联合应用诊断的效能进行评估。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 一般情况

对照组的平均年龄和工龄分别为(42.64±5.81)岁与(22.93±6.36) a，矽肺I 期的平均年龄和工龄分别为(47.06±4.31)岁与(26.05±4.50) a，矽肺II期的平均年龄和工龄分别为(51.30±4.53)岁与(29.96±5.13) a，各组间研究对象的平均年龄和工龄差异均有统计学意义。因此，将年龄及工龄作为协变量，采用协方差分析，将各组指标进行比较，以消除上述因素对检测结果的影响。

2.2 矽肺患者血清中SOD及MDA水平的变化

各组人群血清中SOD 和MDA 水平的比较见表1。结果表明，与对照组相比，矽肺患者血清中SOD水平的差异均无统计学意义(P＞0.05)；矽肺I期及II期患者的血清中MDA 水平分别升高36.62%和33.40%，且差异均有统计学意义(P均＜0.05)。

表1 各组人群血清中SOD和MDA水平的比较

2.3 矽肺患者血清中IL-6及TNF-a水平的变化

各组人群血清中IL-6 和TNF-α水平的比较见表2。结果表明，与对照组相比，矽肺I期及II期患者的血清中IL-6 水平分别升高27.71%和25.25%，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；矽肺I期患者血清中TNF-α水平升高12.37%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组人群血清中IL-6和TNF-α水平的比较

2.4 ROC曲线分析

为了评价各生物标志物对矽肺早期的诊断价值，我们取对照组和矽肺I 期组间比较差异有统计学意义的3个指标绘制了ROC 曲线进行分析。结果显示，曲线下面积(area under the curve，AUC)分别为IL-6(0.86)＞MDA(0.81)＞TNF-α(0.65)，IL-6 与 MDA 的灵敏度和特异性相对较好(表3)。

表3 IL-6、TNF-α及MDA对矽肺早期辅助诊断的ROC分析

2.5 用于矽肺早期辅助诊断的多个生物标志物联合应用模型

采用二分类Logistic回归模型，评估对照组和矽肺I 期组间差异有统计学意义的3 个血清生物标志物在两组样本中诊断的效能，建立矽肺和正常人群中诊断矽肺的Logistic 回归模型：P=-10.21+0.05×CIL-6-0.02×CTNF-α+0.72×CMDA，得到 3 个生物标志物联合检测的AUC为0.89(95%CI：0.84～0.94，P＜0.01)。分析结果显示，这3 个生物标志物的联合应用模型其诊断效能优于单个生物标志物的诊断效能。

3 讨 论

矽肺是由于长期吸入游离SiO2粉尘所引起的职业病。研究发现SiO2有较强的致纤维化作用，SiO2颗粒可促进巨噬细胞持续释放炎性细胞因子，刺激成纤维细胞增殖和促进胶原纤维合成产生纤维化[9-10]。若临床早期能够对这些细胞因子进行检测，将对矽肺早期监测具有重要意义。

在矽肺的发生中，SiO2粉尘作用于肺泡，大量氧自由基生成，这些自由基可作用于膜的不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化反应。MDA是膜脂质过氧化分解的产物，本研究结果显示，矽肺患者血清中MDA水平高于对照组(P＜0.05)，这和王素华等[11]的研究结果一致。IL-6 和TNF-α具有明显的致纤维化作用[12]。IL-6和TNF-α等细胞因子处于炎症瀑布反应的中心位置，被称为促炎症细胞因子(pro-inflammatory cytokines)。在发生炎症反应时，炎症因子释放增加，炎症因子的过度产生是导致组织损伤的主要原因[13-14]。本次研究中矽肺患者血清中IL-6 水平高于对照组(P＜0.05)，与以往的研究结果一致。肺泡巨噬细胞被激活后会释放一种前炎性介质TNF-α，该因子在尘肺早期炎症反应乃至最终尘肺纤维化发生过程中起着重要作用。以往研究发现TNF-α在血清的表达水平争议较大，有学者认为TNF-α在吸入粉尘后异常增多，从而引起体内细胞因子之间相互协调、制约作用的紊乱，最终引起尘肺的发生发展；也有学者认为尘肺患者Th1 细胞活化数量较少或功能减弱，而Th1 细胞以产生TNF-α为主，IL-6 则由Th2 细胞分泌，所以导致尘肺患者血清中TNF-α表达量降低[15]。但是大多数研究者认为尘肺早期为炎症反应，以Th1 细胞反应为主的细胞免疫应答，中晚期以Th2 为主的体液免疫应答，TNF-α表达水平会升高[16]，与本研究结果一致。

此外，在本研究中，就MDA、IL-6及TNF-α水平而言，矽肺I 期和II 期测定结果差异并无统计学意义。笔者认为，主要原因有两点：第一，这些指标并非反映矽肺发生发展的特异性指标；第二，本研究纳入矽肺I 期43例，II 期病例22例，测定结果表现出较大的个体差异性。下一步，应当增加纳入的病例数，进一步研究上述指标在矽肺不同分期病例血清中的变化趋势。

尽管本研究发现IL-6、TNF-α和MDA在对照组和矽肺患者血清中的表达差异有统计学意义。但是仅仅采用血清中的一种生物标志物作为矽肺的标志物往往缺乏特异性，若将多种生物标志物组合有可能提高诊断的准确性。本研究通过对在对照组和矽肺I 期患者表达差异有统计学意义的生物标志物绘制ROC曲线进行分析，诊断灵敏度为65.2%～86.4%。而将这3 个生物标志物组合，建立诊断矽肺的Logistic回归模型，则可使诊断灵敏度达到89.3%。IL-6、TNF-α和MDA 的联合应用检测可以提高矽肺早期辅助诊断的灵敏度和特异性。下一步，可纳入更多层面的指标，进一步探讨多指标联合应用检测方法对矽肺早期辅助诊断的价值。