大鼠β-arrestin2基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定*

陈思思， 周恒， 王继春， 谢菁， 周艳丽， 卢帅， 卢力

(武汉大学人民医院 心内科， 湖北 武汉 430060； 武汉大学 心血管病研究所， 湖北 武汉 430060； 心血管病湖北省重点实验室， 湖北 武汉 430060)

β-arrestins是G蛋白偶联受体，包含了β-arrestin1与β-arrestin2[1]。β-arrestins是一个关键性的调节因子，亦可与多种信号分子直接结合、并调节其活性，参与多种生物活动过程[2-4]。除了调节机体的炎症和免疫反应过程，β-arrestins还被发现是细胞迁移、凋亡中的关键调节因子[5-7]。血管内皮功能障碍是许多心血管疾病的发病基础，而内皮祖细胞通过迁移、增殖、凋亡等参与了血管内皮修复及新生血管形成过程[8-11]。目前对β-arrestin2调节内皮祖细胞过程中的作用尚不明确，所以本次试验采用基因重组技术建立β-arrestin2表达慢病毒载体，系统地研究基因功能对心血管疾病的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1质粒和病毒 过表达质粒载体为GV492，元件顺序Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，克隆位点为BamHI / AgeI，慢病毒辅助包装质粒为Helper1.0和Helper2.0，由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。慢病毒包装细胞为293T细胞由美国ATCC公司提供。

1.1.2主要试剂和仪器 1 kp DNA ladder Marker(美国Fermentas)，In-FusionTMPCR Cloning Kit(美国Clontech)，250 bp DNA ladder Marker(上海捷瑞)，琼脂糖(上海赛百盛)，E001-02B Taq polymerase(上海SinoBio)，D4030A脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)(日本Takara)，引物设计及合成(上海捷瑞)，限制性内切酶(美国NEB)，质粒抽提试剂盒(美国Promega)，改良伊戈尔培养基(dulbecco modified eagle medium，DMEM)(美国Hyclone)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根)，胎牛血清(上海微科)，胰酶(上海化学试剂)，脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen)及HIV-1 p24 Antigen酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)2.0试剂盒(北京达科为)；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(美国Applied Biosystems)，凝胶成像仪(上海天能)，ABI3730型全自动DNA测序仪(上海美季)，HI-9211K型细菌摇床(太仓华利达)，细菌培养箱(上海一恒)，稳压DNA电泳仪(美国BioRad)，Gilson移液器(法国吉尔森)，TGL-16G-A高速离心机(日本日立)。……