HPLC法测定银杏叶中黄酮的含量

刘力铭

摘 要：用高效液相色谱仪测定阆中市银杏叶中黄酮的含量，黄酮甙由70%乙醇一水提取，并用盐酸溶液水解。采用VP-ODSC8柱（150mm×4.6mm，5?m），流动相为甲醇：水（0.3%磷酸）=55：45体系，流速为1mL·min-1，检验波长为360nm，以槲皮素为标准品，在0.0050～0.1000g·L-1范围内，成很好的线形关系，相关系数为0.9995，RSD为1.1%，结果表明：银杏叶中总黄酮平均含量为0.1356%。

关键词：高效液相色谱;黄酮;银杏叶;水解

1前言

目前，银杏叶中黄酮的提取方法有以下几种：（1）水提取法（2）有机溶剂提取法（3）有机溶剂提取---树脂净化法（4）超临界CO2提取法。由于除水提取法外其余几种提取方法不是耗用大量的有机溶剂，操作复杂就是设备昂贵，不利推广。因此，在本课题中，选用设备简单，操作简捷的水提取法。

2实验部分

2.1主要仪器与试剂

主要材料：乐山市中区的银杏叶

主要仪器：日本岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪;VP-ODS色谱柱（150mm×4.6mm，5?m）

提取装置：带回流管的圆底烧瓶

提取试剂：7O%（V/V）乙醇一水溶液250mL;取95%乙醇184mL加入66mL蒸馏水来配制

槲皮素标准溶液：0.2000g·L-1;称取槲皮素对照品0.02000g于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度

二次亚沸蒸馏水无水乙醇甲醇均分析醇

2.2试验方法

2.2.1标准工作曲线制作

移取槲皮素标准储备液1.25，2.5，5.0，10.0，20.0mL，用无水甲醇定容至50mL容量瓶，进样5μL，测定其峰面积。试验结果表明，在0.0050～0.1000g·L-1范围内，槲皮素的峰面积A与浓度C呈线性关系，回归方程A=4X107×C-32642，相关系数为0.9995。

2.2.2样品溶液的制备

将干燥（空气湿度大时，可在80℃烘干0.5h）的银杏叶研磨成粉末，称取银杏叶粉末5.0000g于圆底烧瓶中，加入70%乙醇一水溶液250mL浸泡12h以上，于50—550C的水浴中回流加热5h提取黄酮甙，加HCl（25+75）20mL继续在85℃下回流加热1h，趁热在铺滤纸的瓷漏斗中抽滤，滤渣用乙醇冲洗，滤液及冲洗水转移至500mL烧杯中缓慢浓缩，当浓缩到25mL时将其降温，用无水甲醇定容于50mL容量瓶中。取适量于离心管中，离心10min，取其上清液，供分析用。

2.2.3色谱条件

VP-ODS色谱柱（150mmx4.6mm，5μm）;流动相为V（甲醇：V（0.3%磷酸）=55：45;流速为1mL·min-1;检测器波长为360nm;进样量为5μL;柱温为3O0C。

2.2.4银杏总黄酮含量计算

提取液经HPLC分析，测得样品中主要成分为槲皮素、异鼠李素、山萘酚的峰面积A1，A2，A3。再根据槲皮素标准曲线、平均换算系数（2.51）及回归方程，可得黄酮甙含量，计算公式如下：CT%=[（A1+A2+A3）×a+b]×2.51×50/mS×100%

a为槲皮素浓度与峰面积标准曲线斜率;b为槲皮素浓度与峰面积标准曲线截距;50为样品溶液体积（mL）;ms为样品质量（mg）。

3结果与讨论

3.1流动相的选择

从银杏叶中提出的黄酮甙经水解后，含有槲皮素、山奈酚、异鼠素三种主要黄酮甙元以甲醇—磷酸水溶液（55：45）为流动相，三种成分可获得满意分离，加磷酸的原因可能是黄酮甙元中部分酚羟基电离成甙元阴离子造成，进而使组成的峰形拖尾，但在加入少量磷酸，则峰形明显有所好转。有些文献中流动相中加入少量甲酸也取得很好的效果，但乙腈或四氢呋喃有机改性剂，不能改善山奈酚和异鼠李素的分离效果。

3.2检测波长的选择

在选定的流动相条件下，槲皮素、山奈酚、异鼠李素三种黄酮甙元的最大吸收波长略有差异，但在360nm处均有较强的吸收，为兼顾三者的灵敏度，选择360nm为检测波长。根据槲皮素的色谱图1和文献[1]以及所做的色谱图可知三种黄酮甙元分离见图2。

3.3实验结果

根据2.2.4的计算方法计算出乐山市中区银杏叶中总黄酮的含量为：

CT%=[（A1+A2+A3）×a+b]×2.51×50/mS×100%

将表1中的三种黄酮甙元的峰面积代入上面公式中得：

CT%=0.1356%（a为3×10-8b为0.001）

3.4分析方法检验

3.4.1精密度

在本实验中，称取干燥的银杏叶粉末2g于四个圆底烧瓶中，用70的乙醇-水液进行提取，方法与2.2.2一样，在加盐酸时按比例加入8mI，最后浓缩，定容，分析。经HPLC分析得四次0.1605%，0.1543%，0.1572%，0.1557%，平均值为0.1569%相对标准偏差为1.1%。由此可见分析方法的重现性是比较好的。精密度主要由提取操作的重现性控制，尤其是抽滤和滤液与洗涤液转移，操作时定量、熟练。

3.4.2重现性

按试验方法平行测定试样银杏叶5次，测定总黄酮含量分别为0.1354%，0.1387%，0.1381%，0.1376%，0.1395%，由此可见分析方法的重现性是比较好的。

3.4.3提取效率

槲皮素是一种黄酮甙元，向样品中加入槲皮素标准时不能使其与葡萄糖结合成黄酮甙，即加入的槲皮素仍以游离形式存在，因此，采用向样品中加槲皮素的方法测定回收率，不能保证黄酮甙都是以能被所用提取体系提取出的形式存在，所测回收率不能保证其可靠性，只能检验在提取和水解过程中黄酮甙元的稳定性和方法的重现性。

参考文献：

[1]张春秀，胡小玲，等，银杏叶黄酮类化合物的提取分离[J].化学研究与运用，2001，13（4）：454

[2]程亚青，陶月良，張峰，等.双波长吸光光度法测定植物中黄酮的含量[J].理化检验一化学分册，2002，38