HPLC法同时测定葡萄糖酸氯己定软膏中杂质和主成分的含量

范 馨 屠宝英 卢碧意（广东华润顺峰药业有限公司 佛山 528000）

葡萄糖酸氯己定软膏是皮肤科用药类非处方药药品。本品主要成分为葡萄糖酸氯己定，主要杂质为对氯苯胺。氯己定为阳离子型表面活性防腐剂，具有广谱抗菌作用。其作用机制是改变细菌细胞膜的通透性。该产品质量标准依据为WS-10001-（HD-0153）-2002，通过提取后用紫外检测，该方法操作烦琐，准确性不强。也没有对有关物质（例如主要杂质对氯苯胺）的检验。

本次实验研究采用HPLC双波长检测法同时测定葡萄糖酸氯己定软膏中的降解产物对氯苯胺和葡萄糖酸氯己定的含量。该方法专属性强，精密度好，操作简便，结果准确可靠。

1 仪器与试剂

1.1 仪器：Agilent 1260II型高效液相色谱仪；Dionex U3000型高效液相色谱仪；Starious十万分之一天平（赛多利斯科学仪器公司，型号CPA225D）；超纯水机（广州东锐科技有限公司，型号SIMPLICITY185）；超声波清洗机（新苗，型号 BX3200H）。

1.2 试剂：醋酸氯己定对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100183-201604）；葡萄糖酸氯己定软膏（广东华润顺峰药业有限公司，规格：0.2%，批号：20181101 20180326-2 20180326-3）；对氯苯胺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101398-201601）；色谱甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司，批号：0212180902）；磷酸二氢铵（天津市大茂化学试剂厂，批号：20170109）；冰醋酸（阿拉丁，批号：J1822084）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂[Waters XBridge Shield RP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）或效能相当的色谱柱]；以0.14%磷酸二氢铵溶液（用10%磷酸溶液将pH值调至3.5）为流动相A，以色谱甲醇为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0 mL，检测波长分别为244 nm和259 nm，柱温为35℃。理论板数按对氯苯胺峰计算不低于2000，对氯苯胺峰与相邻峰的分离度应符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 稀释液的制备：将80 mL的冰醋酸转移到1 000 mL量瓶中，倒入色谱甲醇至标线处，摇匀即得

2.2.2 混合对照品溶液的制备：取醋酸氯己定对照品和对氯苯胺对照品适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含葡萄糖酸氯己定0.1 mg（按每1 g的醋酸氯己定相当于1.435 g的C22H30Cl2N10·2C6H11O7计算）、对氯苯胺 0.25 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备：取软膏2.5 g（约相当于葡萄糖酸氯己定5 mg），精密称定，置50 mL量瓶中，加入稀释液约30 mL，置80℃水浴中加热，小心振摇使葡萄糖酸氯己定溶解，放冷，用稀释液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2 h以上，取出后迅速滤过，续滤液放冷，作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液：按样品的处方比例和工艺制备缺葡萄糖酸氯己定的阴性样品，再按“2.2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 各溶液色谱行为：葡萄糖酸氯己定软膏各溶液的色谱图见图1、图 2。

由图1、图2可知：对照品溶液位上的目标检测峰与空白溶剂对比，没有干扰峰。对样品，空白基质进行酸碱破坏，光线破坏，氧化破坏，高温破坏后，主峰附近杂质峰与主峰分离度符合要求，空白基质、空白溶剂主峰出峰时间处均无干扰峰。该方法专属性强。2.4线性关系考察：试验工作曲线绘制：取醋酸氯己定对照品和对氯苯胺对照品适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含葡萄糖酸氯己定1 mg、对氯苯胺2.5 μg的溶液，作为储备液。分别取贮备液 0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL 至10 mL的容量瓶中，分别用稀释液溶解并稀释至刻度，得线性溶液。精密量取对照品线性溶液20 μL注入液相色谱仪，按照“2.1”中的洗脱梯度进行洗脱，记录色谱图。以待测成分浓度为X轴，峰面积为Y轴，作线性回归，回归方程与线性范围见表2。

表2 回归方程与线性范围

2.5 准确度（回收率）：分别精密量取含葡萄糖酸氯己定0.1 mg/mL、对氯苯胺0.25 μg/mL的混合对照品溶液4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，加入含2.5 g空白基质的50 mL容量瓶中，按“2.2.3”项下的方法制成相当于原含量80%、100%、120%的供试品溶液。依法测定，结果见表3。

表3

2.6 精密度与重复性：取同一混合对照品溶液，重复进样6次，测定葡萄糖酸氯己定和对氯苯胺的峰面积RSD分别为0.5%和1.8%（n=6），表明仪器精密度良好；取同一批号样品（批号：20181101），称取6份，按2的测定方法测定。结果葡萄糖酸氯己定的平均标示含量为95.14%，RSD为1.4%；对氯苯胺的平均标示含量为0.063%，RSD为2.3%，表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性：取同一混合对照液和样品溶液，分别于室温下在24 h内，观察溶液性状，是否有变色沉淀等异常现象，并在3、6、9、12、15、18、21 h进样，记录峰面积，混合对照液中氯己定和对氯苯氨峰面积RSD分别为0.4%、0.8%。样品溶液中氯己定和对氯苯氨峰面积RSD分别为0.5%、3.1%。两种溶液的性状均无异常，表明混合对照液和样品溶液在21 h内稳定。

2.8 结论：综上所述，通过采用高效液相色谱法特定的流动相组成以及线性梯度洗脱程序，实现对葡萄糖酸氯己定的含量和有害物质对氯苯胺的含量同时测定。可以准确检测有害物质对氯苯胺的含量，加样回收率在95%以上。可以准确检测葡萄糖酸氯己定的含量加样回收率，在98%～103%之间。

3 讨论

目前，葡萄糖酸氯己定软膏的国家标准依据为WS-10001-（HD-0153）-2002，含量测定时用醋酸氯己定为对照品，计算时再折算。我们也以醋酸氯己定为对照品。将醋酸氯己定的乙醇溶液[浓度为10（g/mL）]在 200～300 nm 的波长处扫描可知，醋酸氯己定在259 nm的波长处有最大吸收。另取对氯苯胺的乙醇溶液[浓度为0.25（g/mL）]在200～300 nm的波长处扫描可知，对氯苯胺在244 nm的波长处有最大吸收。通过各相邻波长的对比实验可知，对氯苯胺的测定波长以239 nm、242 nm、244 nm比较合适；氯己定以257 nm、259 nm、260 nm比较合适。流动相的选择：以磷酸二氢钾和磷酸二氢铵溶液为水相，区别不大；但有机相若更换为色谱乙腈，氯己峰的出峰时间会大大提前，约13 min，而且峰分叉；洗脱梯度的选择：磷酸盐与色谱甲醇在25～35 min的时间段为氯己定峰的时间段，此时两者的比例以（75∶25）至（45∶55）均可以，但当磷酸盐的比例达60%时，氯己定不能正常出峰。色谱柱的选择：由于提取液呈酸性，所以选择酸性柱。对该方法做耐用性考察，用了三个品牌的色谱柱，虽然出峰时间有所不同，但分离效果均相近，表明该检测方法有较好的适用性。