国家口蹄疫防控战略需求与口蹄疫标记疫苗

田波/中农威特生物科技股份有限公司

随着全球控制和净化口蹄疫的进程加快，对口蹄疫疫苗的技术要求进一步提升，急需免疫效果优良，能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗，及其配套的诊断技术。

1 国家口蹄疫防控战略

我国以“强制免疫、清除病原、净化畜群、基本消灭”为口蹄疫防控技术路线，坚持实施“预防为主、免疫和扑杀相结合”的综合防控措施，口蹄疫防控取得了举世公认的成效。

1.1 口蹄疫渐进控制计划（PCPFMD）“口蹄疫渐进性控制计划（The Progressive Control Pathway for Foot and Mouth Disease，PCP-FMD）”是联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO） 和OIE为控制口蹄疫而制定，现在已经成为OIE、FAO共同推荐的口蹄疫控制计划方案，目的在于帮助流行口蹄疫的国家逐渐降低该病的影响，最终达到非免疫无疫。

口蹄疫渐进性控制计划（PCPFMD）将口蹄疫防控状态分为5个渐进的阶段（图1），用于国家或地区评价防控口蹄疫计划的成效。全球控制口蹄疫的主要策略是“分阶段、分区域”，从“无免疫到非免疫无疫阶段”逐步控制。依据PCP-FMD内容的评估规定，我国目前处于PCP第3阶段，即实行根除流行的控制措施、减少病毒循环。我国推进口蹄疫防控参照OIE推荐的PCP-FMD路线图，实行 “因地制宜、分区防治、分型控制”的管理原则，大力推进口蹄疫综合防制策略。

1.2 当前口蹄疫防控考核标准《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》和《国家口蹄疫中长期防治规划（2016—2020年）》（表1），对口蹄疫的防控提出了防治考核标准。到2020年，全国亚洲 I型口蹄疫达到非免疫无疫；全国A 型口蹄疫免疫无疫；O型口蹄疫在海南岛、辽东半岛、胶东半岛非免疫无疫，辽宁（不含辽东半岛）、吉林、黑龙江、北京、天津、上海免疫无疫，全国其他地区维持控制标准。

表1 “国家口蹄疫中长期防治规划”口蹄疫防控目标与要求

1.3 口蹄疫无疫小区建设为有效控制和消灭动物疫病，提高动物卫生及动物产品安全水平，促进动物及动物产品贸易，我国加快推动实施动物疫病区域化管理，规范实施无规定动物疫病小区建设。无规定动物疫病小区是指处于同一生物安全管理体系下的养殖场区，在一定期限内没有发生一种或几种规定动物疫病的若干动物养殖和其他辅助生产单元所构成的特定小型区城。

图1 口蹄疫渐进性控制计划图（PCP-FMD ）

在国家《无规定动物疫病小区管理技术规范》中，明确了“无口蹄疫小区标准”。把从易感动物样品中分离鉴定出口蹄疫病毒，检测出口蹄疫病毒抗原或病毒核酸，以及“非免疫所致的口蹄疫病毒结构蛋白抗体或非结构蛋白（non- structural protein，NS 蛋白）抗体”，作为确定口蹄疫病毒感染的任一依据；把在免疫动物群体中，只要通过病原学监测出口蹄疫病原或口蹄疫非结构蛋白抗体，且口蹄疫非结构蛋白抗体滴度升高，或口蹄疫非结构蛋白抗体阳性动物数量增加，作为判定口蹄疫病毒传播的标准。口蹄疫病非结构蛋白抗体成为评定口蹄疫病毒感染和传播的重要参数，其指标的合格是评估免疫无口蹄疫小区和非免疫无口蹄疫小区的主要条件。

1.4 国家无疫区建设国家实施畜禽健康促进策略，健全种用动物健康标准，推进种畜禽场疫病净化计划，对重点疫病设定净化时限。另外还在我国海南、辽宁、吉林、黑龙江、山东等自然屏障好、畜牧业比较发达、防疫基础条件好的动物疫病防治优势区，以及北京、上海、天津等中心城市，强力推进免疫无疫区建设。

表2 国家“无口蹄疫小区标准”

建设口蹄疫无疫区，是目前动物疫病防控工作的重要抓手，是动物疫病防控成效的示范工程。免疫接种疫苗是预防和控制口蹄疫的关键措施，区分自然感染与疫苗免疫动物、剔除感染者，是免疫无疫区建设的重要举措。区分感染和免疫动物的“金标准”是检测口蹄疫病毒非结构蛋白（3AB或3ABC）抗体，该指标是偶蹄动物及其产品国际贸易必检项目。

1.5 OIE口蹄疫无疫标准区分口蹄疫免疫动物和感染动物能反映一个国家或地区畜群中口蹄疫病毒的感染状态。OIE《动物疫情监测指南》明确提出，一个国家/地区要获得免疫或非免疫无口蹄疫地位的认可，应以检测口蹄疫病毒非结构蛋白（以3ABC的免疫原性最佳）抗体为“金标准”，来证明动物体内无此特异性抗体的产生。

OIE推荐建设口蹄疫免疫无疫区和非免疫无疫区，判定无疫标准为无病原阳性、无病毒非结构蛋白感染抗体。

2 口蹄疫疫苗现状

目前常用的所有口蹄疫疫苗，均存在不能兼顾防疫效果优良和精准区分免疫动物与自然感染动物的问题。由此严重影响了疫情调查、无疫区判定、活畜调运、进出口检疫及贸易，我国急需一种疫苗或是建立一种方法来区别自然感染动物和疫苗免疫动物。

2.1 灭活疫苗我国生产的灭活疫苗安全有效、质量稳定，是当前畜牧业生产中预防口蹄疫的主要疫苗，对我国和周边国家口蹄疫的防控起到了决定性作用。

目前口蹄疫疫苗的生产工艺先进，但还是不能确保完全清除与灭活病毒大小相同的非结构蛋白复合物。多次免疫动物后，非结构蛋白抗体累积，仍可检测到口蹄疫病毒3AB或3ABC抗体。实验数据显示：免疫1～3次，检出率约为3%～7%；免疫3次以上，检出率约为11%～15%。这给以检测非结构蛋白抗体为“金标准”的疫苗免疫和病毒感染动物的鉴别诊断带来了困难，严重阻碍口蹄疫流行病学监测和疫源净化，给无疫区建设造成极大障碍，已成为全球口蹄疫控制计划实施的技术障碍。

2.2 合成肽疫苗合成肽疫苗是以口蹄疫病毒抗原表位的蛋白质序列为依据，将肽段用人工方法合成拼接到大分子载体上作为抗原，加入佐剂制备而成。合成肽为线性结构，无法模拟完整口蹄疫病毒粒子的空间构象性抗原表位。合成肽疫苗因无非结构蛋白抗体干扰，免疫动物后便于区分感染和免疫动物。

合成肽疫苗免疫效力还是有一定的局限性，尤其是免疫牛之后其效力不如常规灭活疫苗，因此目前合成肽疫苗主要用于猪口蹄疫的防控。

3 口蹄疫标记疫苗

面对国家重大动物疫病的防控需求，针对现用疫苗存在的问题，亟待开发一种既能有效免疫预防，又能满足口蹄疫净化技术要求的鉴别诊断疫苗，为口蹄疫的有效预防、控制乃至消灭提供新的技术支撑。

3.1 标记疫苗标记疫苗（Marker vaccine）也称鉴别诊断疫苗（Differentiating infected from vaccinated animals，DIVA），通过缺失病毒某段致病相关基因或优势表位基因，或插入相关基因来构建标记病毒，还可同时修饰抗原表位基因，拓展病毒抗原谱、提高免疫原性，从而获得理想毒株而制造疫苗。

随着 RNA病毒反向遗传操作技术的不断发展，推动了各类重大动物疫病基因缺失标记灭活疫苗的开发。到目前为止，已经成功发展了猪瘟病毒、新城疫病毒、呼吸与繁殖障碍综合征和马动脉炎病毒等的基因缺失标记疫苗。未来标记疫苗的发展以病毒抗原位点的解析为基础，来提高疫苗免疫效果，研制多价标记疫苗和储备标记疫苗，并建立配套的精准鉴别诊断方法。

口蹄疫标记疫苗由于缺失或改造沉默了口蹄疫病毒非结构蛋白的优势表位基因，免疫动物不产生针对缺失或原始表位的抗体，从而利用配套的病毒非结构蛋白（抗原/表位）抗体血清学检测方法能精确区分自然感染和免疫动物。该类疫苗不仅拥有灭活疫苗免疫效力最优的特性，而且无常规疫苗多次免疫干扰鉴别诊断的缺陷。

3.2 猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗（O/r V-1株）猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗的制苗毒株“O/r V-1株”，是以口蹄疫Cathay型疫苗株O/ZK/93-08的全长感染性cDNA为骨架，成功嵌合了O型Mya98系O/Mya98/JX/2011毒株的结构蛋白VP1基因，缺失和改造了非结构蛋白3A和3B优势表位基因，成功拯救出的重组病毒培育而来。“O/r V-1株”猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗，彻底根除了非结构蛋白抗体干扰，符合我国口蹄疫防控的技术需求，将有力支撑我国口蹄疫无疫区的全面建设。

以口蹄疫O/ZK/93-08毒株基因组序列为基础，利用口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台，构建缺失非结构蛋白3A3B优势表位负标记的重组病毒，制成的疫苗是一种既能有效免疫预防，又能与自然感染相区别的口蹄疫标记疫苗。中农威特生物科技股份有限公司参与技术支撑单位兰州兽医研究所对该疫苗的研制，并取得了生产批准文号。

猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗（O/r V-1株）具有“有效免疫预防，推进净化无疫”的特点，拥有四大显著优势：分子标记疫苗，国际首创技术支撑国家口蹄疫防控战略；反向遗传平台，整合毒株优势，拓宽抗原谱，提高免疫原性；基因缺失技术，精准鉴别口蹄疫疫苗免疫和自然感染动物；国家一类新兽药，优势毒株优异生产工艺优化免疫效果。

3.3 标记疫苗配套检测试剂盒在FMDV的几种非结构蛋白中，3D是最早用于诊断的非结构蛋白，能与感染动物血清反应，由此建立的免疫扩散试验与动物食道咽部病毒分离技术相结合，曾被认为是一种可靠的鉴别诊断方法；由于反复接种灭活疫苗的动物体内会不同程度地产生抗3D抗体，该方法受到质疑。后来的研究中，发现2B的抗体重复性不好，不宜作为检测抗体的抗原。2C、3A和3ABC的抗体存在可作为鉴别感染和疫苗接种动物的指标；由于3ABC抗体在感染后早期就出现，且维持时间长，因此感染标志抗体3ABC是最为可靠的、可单独使用的指标。猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗（O/r V-1株）的种毒，缺失了3A和3B优势表位，检测3AB或3ABC抗体的试剂盒均满足配套。

图2 标记疫苗技术路线图

目前常用的检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法和试剂盒主要有：口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测试剂盒，口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC单抗阻断ELISA抗体检测试剂盒，以及口蹄疫病毒2C3AB抗体检测试纸条 。

其中口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测试剂盒应用较为广泛。通过检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体，来鉴别诊断病毒感染动物和灭活疫苗免疫动物。用3ABC基因表达蛋白包被ELISA板，洗板封闭。检测时，加入待检血清样品，如果血清样品中有3ABC抗体，则与ELISA板上的3ABC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再与酶标二抗结合，加入底物后，就会出现颜色反应。如果待检样品为阴性，就不能形成抗原-抗体复合物，酶标二抗不会结合，因此就不显色。该方法可检测牛、羊和猪血清，不区分血清型；检测操作步骤简单，用时在2h以内；且具有良好的敏感性和准确性。

4 小结

我国重大动物疫病和重点人畜共患病计划防治策略和目标，就是有计划地控制、净化、消灭对畜牧业和公共卫生安全危害大的重点病种，推进重点病种从免疫临床发病向免疫临床无病例过渡，逐步清除动物机体和环境中存在的病原，为实现免疫无疫和非免疫无疫奠定基础。

口蹄疫疫苗技术的进步对预防、控制、净化口蹄疫，建立免疫无疫区和非免疫无疫区，最终消灭口蹄疫，起着决定性的作用。“猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗（O/rV-1株）”抗原保留病毒“准种””特征信息，免疫效力最优，缺失3ABC优势表位，不干扰感染和免疫鉴别。近期，中农威特还将推出猪牛羊通用、一针防控O型和A型口蹄疫二价标记疫苗。这些口蹄疫标记疫苗是口蹄疫病毒灭活疫苗研究领域又一个具有划时代意义的标志性成果，符合全球口蹄疫防控趋势和我国口蹄疫的净化政策需求。