背根神经节中TRPV1 激活对钠-钾-氯共转运体表达和功能的影响 *

邓诗瑜 许珍珍 陈沁怡 谭朝阳 田俊杰 王 洋 马克涛 李 丽 司军强 马新军

（1 新疆石河子大学医学院 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002，2 新疆昌吉州人民医院麻醉科，昌吉 831100，3 襄阳市中心医院麻醉科，襄阳 441000；4 广州医科大学附属第一医院麻醉科，广州510120；5 华中科技大学同济医学院协和医院麻醉科，危重症医学研究所，武汉430022）

疼痛在人群中的发病率越来越高，有关疼痛的作用机制复杂多样，故对寻求疼痛新的作用机制的研究至关重要。瞬时感受器电位香草酸受体1 (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1) 是一种非选择性的阳离子通道，广泛分布于哺乳动物的感觉神经元，尤其是与痛觉有关的无髓鞘C类纤维和部分少髓鞘的Aδ 类纤维[1]，有研究表明，在脊髓水平突触前TRPV1 的激活会使伤害性信息的传入增多，增加炎性疼痛的产生[2]，TRPV1 不仅参与疼痛的调控，TRPV1 的激活还可能诱发释放神经肽等，与痛觉过敏的发生密切相关[3]。已有研究发现，在初级感觉神经元中，TRPV1 被激活后可同时激活钙激活的氯离子通道，正反馈促进TRPV1激活引起的去极化，进而加剧疼痛的发生[4,5]，表明Cl-参与了痛觉的调制。钠-钾-氯共转运体(sodium-potassium-chloride co-transporter 1, NKCC1)是一种内向的“Cl-泵”[6]，在中枢神经系统中与KCC2 共同维持神经细胞中的Cl-浓度的稳态。而成年后大鼠DRG 上主要表达NKCC1，以维持细胞内高Cl-状态[7]。本课题组前期实验发现CCI 模型后NKCC1 在DRG 上的表达明显增加[7]。另有研究显示[8]，结肠内注射辣椒素后，可以在相应节段脊髓背角中发现NKCC1 的表达上升，以上研究结果均提示NKCC1 参与疼痛的调节，可能成为治疗疼痛的靶点。因此，本研究主要目的是观察在初级感觉神经元背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)上，在大鼠足底给予辣椒素激活TRPV1 受体后，NKCC1 表达和功能的变化以及对疼痛的影响，进而明确疼痛发生时NKCC1 可能作用及机制，为临床治疗疼痛提供理论依据与可能的治疗新靶点。

方 法

1.实验动物及分组

200 只雄性SD 大鼠购自新疆医科大学动物实验中心（许可证编号 SCXK New 2003-0001）。饲养条件为：12 h 昼夜交替，室温20℃～25℃，湿度60%～70%，自由饮食水，通风良好。180～250 g大鼠供实验使用，使用之前，先适应周围环境1 周。将大鼠随机分为：正常组 (n = 24)、辣椒素组 (n = 36) 和辣椒素+布美他尼组 (n = 6)。

2.试剂、仪器

免抗NKCC1 多克隆抗体（美国，Cell Signaling 公司）；免抗p-NKCC1 多克隆抗体（美国，Merck 公司）；小鼠抗TRPV1 单克隆抗体（美国，Abcam 公司）；NKCC1 的抑制剂布美他尼（美国，Abcam 公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG、FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC 标记山羊抗小鼠IgG、（中杉金桥），其余试剂均为国产分析纯试剂。全自动热幅射刺激仪(UGO BASILE 37370 Plantar Test Apparatus, Italy)；电源、电泳仪、电转仪（北京，六一仪器厂）；LSM510 激光共聚焦显微镜（德国，Carl Zeiss 公司）；胰蛋白酶Type III、胶原酶Type IA、胰蛋白酶抑制剂、DMEM 培养基（美国，Sigma 公司）；Multi Clamp700B 膜片钳放大器（美国，Axon 公司）；P-2000 微电极拉制仪（美国，Sutter 公司）；Digidata 1550A 数据采集系统（美国，Axon 公司）；MP-225 微操纵仪（美国，Sutter 公司）。

3.实验方法

（1）模型制备：支配足底的神经是从L3-6发出，本研究通过大鼠足底注射辣椒素构建急性神经源性炎症模型[9]，观察L3-6神经节蛋白的变化情况。在4%七氟醚麻醉下，大鼠左侧足底皮下注射辣椒素(3 mg/ml)（APExBIO，A3278，美国）模拟急性神经源性疼痛，即刻可以观察到大鼠大腿回缩，使针尖停留于皮下数秒，待药物吸收完全后拔出针头，此时可见大鼠大腿回蹬、甩足。待大鼠数秒清醒过后，进行后续实验。

参照Pogatzki 等[10]的方法, 在正常大鼠身上行鞘内置管术。将大鼠麻醉后俯卧固定、备皮、在L5-6上方做纵切口，依次分离组织，用PE-10 导管穿过椎间隙，若看到尾部或者后肢抽动，同时有清亮的脑脊液流出，则固定导管，经皮下隧道于颈部传出，外露2 cm 左右固定，待大鼠清醒，通过导管注射2%利多卡因10 μl，若在注射后30 s 内出现双下肢瘫痪并于30 min 内恢复，则判断置管成功。

（2）痛行为学测试：各组分别在术前1 h、术后10 min、30 min、60 min、120 min 随机抽取6 只大鼠进行热痛阈值和冷痛阈值测定。热痛阈值依据Hargreaves 等[11]的方法进行操作。在安静环境中，将大鼠单独放入底部透明的有机玻璃箱内提前适应周围环境10～15 min 后，用热辐射刺激仪热源垂直照射注射辣椒素侧的皮肤，记录从照射开始至大鼠抬足时间，最长时间为30 s，测定时保持刺激强度相同。每一个时间点重复测定3 次，每次至少间隔5 min，取3 次平均值为热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)[12]。TWL 值越低，表示大鼠对热刺激的痛觉过敏越严重。

冷痛阈值根据Norcini 等[13]的方法，将大鼠放置在自备网笼内，待其安静后，将0.1 ml 丙酮滴到大鼠注射辣椒素的左后足底皮肤上，并同时计时。记录大鼠抬足至将足放下的时间，即为大鼠的冷刺激抬足时间。每一个时间点重复测定3 次，每次至少间隔5 min，取3 次平均值为冷缩足反射潜伏期(cold withdrawal latency, CWL)。CWL 值越高，表示大鼠对冷刺激的痛觉过敏越严重。

（3）免疫荧光：腹膜内注射1%戊巴比妥钠深度麻醉大鼠，暴露心脏，用针尖从心尖稍偏左的位置刺穿左心室壁进入升主动脉，将右心耳剪破。用生理盐水灌流至流出的液体澄清，之后换用4%的多聚甲醛继续进行灌流，观察到大鼠四肢及头颈部僵硬为止。随后沿棘突依次剪开椎管，暴露脊髓，在显微镜下迅速剥离背根神经节。将修剪好的DRG置于4%多聚甲醛中后固定12 h，脱水后石蜡包埋，制作石蜡切片(5 μm)。石蜡切片进行常规的脱蜡，用枸橼酸进行抗原修复，破膜，5% BSA 封闭1 h，一抗4℃过夜孵育：共同孵育小鼠抗TRPV1 (1:50)和兔抗NKCC1 (1:100)，单独孵育兔抗p-NKCC1 (1:100)。复温，PBS 清洗3 次，37℃避光孵育对应的二抗1 h：TRITC 标记山羊抗小鼠IgG、FITC 标记山羊抗兔IgG，再用PBS 清洗3 次，滴加抗荧光淬灭封片剂进行封片，共聚焦显微镜下观察计数并摄取图片。选用Image-J 图像分析软件进行阳性细胞面积率的统计。

（4）Western blotting：大鼠麻醉后处死，取L4-6节段脊柱，置于人工脑脊液(aCSF):1.3 mmol CaCl2·2H2O, 2.6 mmol KCl, 0.9 mmol MgCl2, 21 mmol NaHCO3, 2.5 mmol Na2HPO4·7H2O, 125 mmol NaCl, 3.5 mmol 葡萄糖，pH 7.2～7.4 中，在显微镜下分离术侧DRG，剪碎后加入裂解液，提取总蛋白，用BCA 法对蛋白浓度进行测定，100℃，10 min 使蛋白变性，取一定量的蛋白样品进行SDS-PAGE 凝胶电泳，电转至0.45 nm PVDF 膜上后，5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗4℃摇床过夜孵育。TBST 洗膜3 次，用二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，孵育2 h，再次用TBST 洗膜3 次，加入新鲜配制ECL 荧光显色。采用Image-J 软件进行结果分析。

（5）急性分离DRG 神经元：参考本实验室前期采用的方法[14]，大鼠麻醉后处死后，取L4-6节段脊柱，放入盛有氧饱和的细胞外液中(NaCl 150 mmol/L,KCl 5 mmol/L, MgCl21 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, D-glucose 10 mmol/L, Sucrose 20 mmol/L, CaCl23.32 mmol/L,pH 为7.2～7.4，渗透压为320～350 mOsm)。用精细角膜剪和游丝镊分离修剪DRG，将DRG 充分剪碎，用消化酶（胰蛋白酶Type III 0.24 mg/ml 和胶原酶TypeIA 0.6 mg/ml，溶剂为DMEM 培养基）在37℃水浴锅中消化3～4 min。消化结束后立即加入少量胰蛋白酶抑制剂终止消化。静置待细胞贴壁，待细胞贴壁充分后，加入氧饱和的细胞外液。

（6）膜片钳：镜下选取膜表面光滑、透亮、状态良好的直径在30～50 μm 的DRG 细胞作为实验对象[15]。选取电阻值为2～8 MΩ 的微电极，充灌电极内液(K-Gluconate 130 mmol/L, NaCl 10 mmol/L, MgCl2·6 H2O 1.2 mmol/L, CaCl22 mmol/L, EGTA 5 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, D-Glucose 7.5 mmol/L, pH值为7.2～7.4，渗透压为320～350 mOsm)，将充灌好细胞内液的玻璃微电极连接在微操纵仪上。操作微操纵仪，电极尖端接触细胞，接触细胞的瞬间可以从膜测试窗口观察到电极电阻略微升高。用嘴吸法给予微电极内部一定负压，同时将钳制电位逐步调节至-60 mV，待细胞与电极间形成GΩ 封接后，用嘴吸破膜法或同时辅助以电击破膜法破膜。破膜后，阻值仍维持在GΩ 以上的细胞用于实验。在显微镜下记录细胞直径。所用药物：γ 氨基丁酸(γ-amino-butylic acid, GABA)(10-4M)、辣椒素(10 μM)，以上药物用排药管给药，给药管口距离所记录细胞100 μm。记录的信号经Multi Clamp 700B 膜片钳放大器放大，给予10 kHz 的滤波后，由AxonDigidata 1550A 数模/模数转换器转换，采样频率为10～20 kHz。

（7）氯离子荧光探针(MQAE)：足底给予辣椒素60 min 后，急性分离各组大鼠DRG，用眼科剪剪碎、消化、离心、弃上清，加入96 孔板中，抑制剂组孵育布美他尼(10 μM) 30 min，吸出后再加入含有布美他尼的MQAE 缓冲液，37℃孵育30 min，缓冲液清洗，荧光显微镜拍照。当氯离子浓度升高时，MQAE 的荧光强度随着氯离子浓度的增加而降低。

4.统计学分析

结 果

1. TRPV1 和NKCC1 在DRG 上的分布

DRG 可以根据细胞直径分为小细胞(＜ 25 μm)，中细胞（25 μm ≤直径＜ 40 μm），大细胞(≥40 μm)。以往的研究证实在DRG 神经元细胞中，传递伤害性感受信号主要是无髓鞘的C 类纤维和有髓鞘的Aδ 纤维，而绝大多数都是中小型细胞[15]。免疫荧光结果显示，在正常大鼠DRG 神经元上可观察到TRPV1 主要在中小型细胞上表达，而NKCC1 不仅在大细胞的膜上有表达，在中小型神经元细胞上也有表达，并且观察到TRPV1 和NKCC1 在中小型神经元细胞存在共表达（见图1）。

2.足底注射辣椒素后大鼠疼痛行为学改变

足底注射辣椒素后，发现大鼠TWL 降低，而CWL 明显延长，60 min 左右可见大鼠抬足、舔足时间明显增加；而鞘内给予NKCC1 抑制剂布美他尼(5 μg/μl)后给予辣椒素，大鼠TWL 和CWL 均有所恢复（见图2）。

3.给予辣椒素后DRG 上NKCC1 及p-NKCC1的蛋白分布及其变化

免疫荧光结果显示（见图3），辣椒素组NKCC1 在中小细胞的核膜上表达明显增多，而p-NKCC1 在中小细胞的细胞膜上表达增多。Western blotting 结果显示（见图4），辣椒素组DRG上NKCC1和p-NKCC1 的蛋白表达量均增加，在60 min 时表达量最高，蛋白变化与行为学变化一致。

4. GABA 的激活电流

图1 免疫荧光显示正常组TRPV1 和NKCC1 表达分布情况 标尺 = 50 μmFig. 1 Immunofluorescence showing distribution of TRPV1 and NKCC1 in the DRG Scale bar = 50 μm

图2 足底注射辣椒素后疼痛行为学变化 (n = 6, ±SD) ***P ＜ 0.001，&&&P ＜ 0.001，与正常组相比；###P ＜ 0.001， $$$P ＜ 0.001，与辣椒素组相比Fig. 2 The change of pain behavior after plantar injection of capsaicin (n = 6, ±SD) ***P ＜ 0.001, &&&P ＜ 0.001, compared with the control group; ###P ＜ 0.001, $$$P ＜ 0.001, compared with the capsaicin group.

选取直径大小为30～50 μm DRG 细胞，排药管给予辣椒素(10 μM)后检测的GABA 激活电流相比正常组明显增加；在给辣椒素之前孵育布 美 他 尼(10 μM)15 min，GABA 的 激 活 电 流 减小。各组的GABA 激活电流大小依次为：正常组(151.93±18.50) pA、辣椒素组(540.77±45.91) pA、布美他尼组(211.43±24.36) pA（见图5）。

5.给辣椒素后大鼠DRG 神经元中氯离子浓度的变化

氯离子荧光探针结果显示：辣椒素组DRG 神经元细胞内氯离子浓度比正常组明显增高，布美他尼组氯离子浓度有所降低（见图6）。

讨 论

有关疼痛的机制复杂多样，其中离子通道的改变是形成异常放电、引起疼痛的主要原因之一。本研究的痛行为学结果显示辣椒素组TWL 降低、CWL 延长，而给予布美他尼预处理后TWL 升高、CWL 缩短；免疫荧光和western blotting 显示在正常大鼠DRG 神经元上TRPV1 和NKCC1 在与疼痛相关的中、小DRG 神经元上共表达，激活TRPV1 后NKCC1 在核膜上的表达增多，而p-NKCC1 在胞质中或胞膜上表达明显增加；荧光探针结果显示辣椒素组DRG 神经元内Cl-浓度明显增加，给予布美他尼预处理后Cl-浓度降低，这些结果均提示TRPV1的激活可以引起NKCC1 的改变，并加重实验动物的疼痛。

图5 膜片钳记录(A)正常组；(B)辣椒素组；(C)辣椒素+布美他尼组的GABA 激活电流大小(n = 6)Fig. 5 Patch clamp recording of GABA currents (n = 6) in the control group (A); the capsaicin group (B); the bumetanide group (C).

图6 氯离子荧光探针显示(A)正常组、辣椒素组和辣椒素+布美他尼组，大鼠DRG 中细胞内氯离子的浓度变化(n = 3) 标尺 = 100 μm；(B)各组荧光密度的比较 **P ＜ 0.01，与正常组相比；#P ＜ 0.05，与辣椒素组相比Fig. 6 Chloride ion fluorescent probe shows (A) changes in intracellular chloride ion concentration in DRG of control group, capsaicin group, and bumetanide group (n = 3). Scale bar = 100 μm; (B) statistical diagram of fluorescence density of each group. **P ＜ 0.01, compared with the control group; #P ＜ 0.05, compared with the capsaicin group.

有研究显示，在正常大鼠DRG 神经元上NKCC1 mRNA 与TRPV1 在中、小型神经元上存在共表达[16]。Galan 等[17]在小鼠腹部结肠内给予辣椒素10 min 后，发现脊髓背角快速短暂的p-NKCC1 变化，并且给予布美他尼后，可以阻断辣椒素引起的疼痛。Mòdol 等[18]发现在坐骨神经损伤2 周后，给予布美他尼可以防止痛觉过敏的出现。另有研究显示[19]，高渗环境中会激活晶状体上TRPV1 通道，使大量的Ca2+内流，激活ERK/OSR1 等激酶，进而使NKCC1活化。也有研究发现[20]，辣椒素能引起小鼠脊髓内Ca2+/CaMKII 的快速激活，使NKCC1 发生磷酸化。但是有关初级感觉神经元上NKCC1 的活化是否可以在功能上增强TRPV1 引起的疼痛，目前还不明了。

本研究结果显示，大鼠足底给予辣椒素激活TRPV1 后，可能通过非选择性的阳离子通道促使Ca2+内流，也可能通过激活神经元细胞内的Ca2+/ CaMKII 或相应的激酶，使NKCC1 和p-NKCC1 的蛋白表达增加，同时使NKCC1 通道蛋白活化。本研究结果还表明，辣椒素组NKCC1 在DRG 神经元的核膜上表达增加明显，而p-NKCC1 在细胞质和细胞膜上的表达增加明显，这可能与TRPV1 激活后NKCC1 的转录和翻译增强，新合成NKCC1 增加，同时使磷酸化后的p-NKCC1 由核膜转运至细胞质或细胞膜发挥生理功能有关。

不仅如此，本研究电生理结果显示，辣椒素组DRG 神经元GABA 激活电流明显增加，同时氯离子荧光探针结果也显示，辣椒素组DRG 神经元内氯离子浓度明显增高，但预处理布美他尼均能逆转辣椒素激活TRPV1 后的作用，提示辣椒素激活TRPV1 后，NKCC1 不仅表达量增加，而且转运Cl-的能力也明显增强，使DRG 神经元内保持较高水平的Cl-浓度。DRG 神经元内的Cl-浓度升高如何引起辣椒素激活TRPV1 后的疼痛加剧？推测可能有两方面的原因：第一，在初级感觉传入的外周端，由于TRPV1 和钙激活氯离子通道相互作用[4,5]，当DRG 神经元中Cl-浓度提高时，TRPV1 激活后引起的钙激活氯离子通道开放，Cl-外流介导的去极化正反馈作用加强，因而使外周痛觉感受器部位更容易爆发动作电位，产生疼痛。第二，在初级感觉传入的中枢端，初级传入的兴奋到脊髓背角激活抑制性中间神经元，其末梢释放GABA，正常时GABA能神经元作为中间抑制性神经元参与初级感觉传递的调节，可通过GABA 能神经纤维与初级感觉末梢中枢端形成的突触，降低初级感觉末梢中枢端突触前膜的膜电位，产生初级传入去极化，使突触前膜Ca2+内流减少，驱动突触小体融合成突触囊泡释放的兴奋性神经递质减少，发生突触前抑制，产生抑制疼痛作用。但是当TRPV1 激活后，DRG 神经元内由于NKCC1 的活动增加使Cl-浓度大大提升，此时中间抑制性神经元激活释放的GABA 作用于GABAA受体，开放Cl-通道，Cl-外流增加（内向电流加大，见图5），使初级感觉末梢中枢端突触前膜的膜电位发生急剧的、过度的去极化而达到阈电位引发动作电位，可直至引起背根反射(dorsal root reflex, DRR)，产生痛敏[21]引起疼痛。

综上所述，通过足底注射辣椒素激活TRPV1，能使NKCC1和p-NKCC1的蛋白及其功能发生改变。因此，认为TRPV1 激活后不仅只激活了非选择性的阳离子通道引起疼痛，而且可以活化NKCC1，使通道开放，提高DRG 神经元胞体中的Cl-（阴离子）浓度，正反馈地加强了TRPV1 引起的疼痛，表明TRPV1 和NKCC1 两者共同对疼痛产生调节。但TRPV1 激活后对NKCC1 调节的中间机制还不清楚，仍需要去进一步的探讨。