IL-10和TREM-1水平与急性胰腺炎大鼠病情进展的相关研究

高晓洁,马德超,王树成

天津市武清区人民医院,天津 301700

急性胰腺炎(AP)是多种病因引起胰酶在胰腺内被激活导致胰腺组织自身消化的炎症反应,由于病情复杂、进展较快,常伴有免疫失调,疾病早期即可出现全身炎性反应综合征(SIRS)。炎症反应进一步加重可合并感染,导致多器官功能障碍(MODS)。临床上尚未明确其发病机制,治疗难度明显增加[1-2]。虽经早期积极治疗,但仍有约20%～30%的急性胰腺炎患者出现感染性并发症、多器官功能障碍[3]。目前关于急性胰腺炎病理过程中的细胞因子平衡学说的研究较多,一般认为多种炎症因子和白细胞参与了急性胰腺炎及其并发症的病理过程。该过程存在“炎症因子-白细胞-炎症因子”的放大反应,进而引起全身炎症反应和器官损伤。白细胞介素-10(IL-10)是一种Th2细胞因子,对所有炎性细胞因子从合成到释放都有抑制作用,作为一种经典的细胞抗炎因子具有抑制炎症反应和免疫调节的作用[4-5]。髓样细胞触发性受体-1(TREM-1)是由Bouchon等[6]于2000年首次确认的一个与炎症相关的TREM 成员,是激发、放大炎症反应的重要介质。本实验通过建立不同病情急性胰腺炎大鼠模型,检测各组血淀粉酶水平、IL-10、TREM-1含量,以判断IL-10、TREM-1水平是否与胰腺炎发病时间、病情严重程度及预后是否具有相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性清洁级SD 大鼠50只,体质量250～350 g/只,购自上海史莱克实验动物责任有限公司,许可证号:SCXK(沪)2012-0002。在室温20～28 ℃、相对湿度40%～60%的动物饲养房中适应性喂养1 周左右。本实验所需的IL-10、TREM-1试剂盒购自武汉华美生物公司,甲醛购自天津市风船化学试剂科技有限公司,牛黄胆酸钠购自chemical book公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组方法

随机将大鼠分为3 组:对照组10 只,MAP 组(急性轻型胰腺炎)20 只(12 h 和24 h 各10 只),SAP组(急性重症胰腺炎)20只(12 h和24 h各10只)。术前12 h禁食水。实验过程中的动物处置符合2016年科技部关于善待实验动物规定。

1.2.2 急性胰腺炎大鼠模型的建立

根据文献报道的方法建立急性胰腺炎模型[7-8]。对照组仅翻动十二指肠和胰腺,后随即关腹。手术过程严格遵守无菌操作原则,术后禁食,自由饮水,背部皮下多点注射生理盐水(按体质量,4 mL/100 g)。

1.2.3 标本采集

分别于术后12、24 h在无菌操作下打开腹腔。由膈肌进入胸腔,抽取心尖部2～3 mL 血液,收集后立即用低温离心机3 000 r/min于4 ℃离心10 min,取上清,密封储存于-80 ℃冰箱保存备用。灭菌外科剪剪下胰腺组织固定于体积分数为10%多聚甲醛,多聚甲醛固定的胰腺组织常规石蜡包埋、切片,HE染色常规病理染色、免疫组化染色等后续检测。

1.2.4 ELISA 检测血清IL-10、TREM-1含量

按照ELISA 试剂盒说明书进行操作。将各组大鼠血清加入预包被抗NSE 特异性抗体的酶标板上,37 ℃温育30 min,倾去液体,加入酶标试剂50 μL,37 ℃温育30 min,洗涤,加入50μL 显色剂A,再加入50 μL 显色剂B,轻轻振荡混匀,37 ℃避光显色15 min,加入50 μL终止液,于450 nm 波长处酶标仪读数吸光度值(A)。

1.2.5 生化法检测血淀粉酶水平

血清淀粉酶水平通过自动生化检测仪检测,由检验科医师采用双盲法进行检测。

1.2.6 HE染色实验步骤

石蜡包埋→切片→70 ℃烤片30 min→二甲苯脱蜡2次,每次30 min→无水乙醇Ⅰ 5 min→无水乙醇Ⅱ 5 min→体积分数为95%的乙醇Ⅰ 5 min→体积分数为80%的乙醇5 min→体积分数为70%的乙醇5 min→Harris苏木素液5 min→水洗(要防止组织脱落,勿用水直接冲洗)→体积分数为1%的盐酸酒精分色1 s→水洗返蓝15 min→体积分数为70%的乙醇5 min→体积分数为80%的乙醇5 min→伊红液(体积分数为95%的乙醇溶液)15 s→体积分数为95%的乙醇Ⅰ 1 min→无水乙醇Ⅰ5 min,无水乙醇Ⅱ 5 min→二甲苯Ⅰ 5 min→二甲苯Ⅱ 5 min中性树胶封片,镜下观察拍照。

1.2.7 胰腺组织病理学观察方法

组织切片HE 染色后封片,倒置显微镜下观察结果,拍照。由两名病理医师采用双盲法在光学显微镜下观察胰腺病理学变化。每只动物取2 张切片,每张切片随机取5个视野。胰腺病理评分参考文献[9]。

1.3 统计学方法

应用SPSS 20.0软件分析。观测结果均为计量资料,采用±s描述。应用成组样本t检验分析组间差异,应用配对样本t检验分析组内前后差异。应用Pearson相关检验分析指标间的相关性。P<0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAP组、SAP组大鼠12 h胰腺组织病理学评分

血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。SAP组12 h血清淀粉酶、IL-10、TREM-1 水平均高于MAP 组(P<0.05)。具体数据及详细的组间组内比较结果见表1。

2.2 不同病情程度大鼠在不同时间点血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平与病理学评分的相关性分析

Pearson相关性分析显示:SAP大鼠和MAP大鼠,其IL-10、TREM-1水平及血清淀粉酶水平,均与病理学评分呈正相关(P<0.05)。见表2、图1。

2.3 光镜下SAP 大鼠24 h胰腺组织与对照组观察结果比较

光镜下对照组可见胰腺组织为典型的正常结构,腺体细胞结构清晰,未见坏死改变及炎性细胞浸润。而急性重症胰腺炎24 h光镜下见胰腺组织水肿明显,腺体结构破坏,细胞结构模糊,部分腺泡细胞坏死伴有大量炎性细胞浸润,见图2。

表1 不同病情程度各组大鼠在不同时间点胰腺组织病理学观察、血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平比较

表2 不同病情程度大鼠血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平与病理学评分Vs的相关性分析

图1 两组合并资料的相关数据散点图(N=40)

图2 各组大鼠的典型光镜图

3 讨论

急性胰腺炎由于发病机制复杂,炎症反应是病情进展的核心问题[10]。SAP发生时,炎症细胞异常激活,大量炎性因子释放,启动炎症因子的瀑布样反应,导致SIRS甚至多器官功能衰竭发生。IL-10是一种被广泛研究的抗炎细胞因子,具有免疫调节、抗凋亡等多种作用,其在体内关键作用就是抑制炎症反应。Yasuda等[11]在制备急性胰腺炎小鼠模型术后第1～3天发现,小鼠胰腺内IL-10 mRNA 表达增高。王茂旭等[12]制备成急性水肿性胰腺炎和急性出血坏死性胰腺炎犬模型并与正常犬对照,发现在生理状况下犬血清中IL-10活性极低或不存在,急性胰腺炎早期血清中即可检测出IL-10,出血坏死性胰腺炎组犬血清IL-10活性明显低于水肿性胰腺炎组。孟杰等[13]在人体的研究中显示血清IL-6、IL-10、TNF-α可预测急性胰腺炎的患病严重程度。许多研究[14]证明,IL-10在克罗恩病、类风湿性关节炎等炎症性疾病治疗上取得一定效果。研究表明:IL-10通过拮抗性调节IL-1,抑制多种炎性反应,并可诱导免疫耐受,从而降低过度免疫反应引起的损伤。髓样细胞表达触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM)家族是一类新发现的免疫球蛋白超家族的成员、TLR 信号免疫调控分子,可通过放大或抑制TLR 信号从而调控免疫应答反应强度,避免过度炎症反应和自身免疫性疾病的发生。TREM 家族成员中,TREM-1最初被认为在脓毒血症相关的SIRS 中充当放大器的作用。其中TREM-1能加强炎症反应、正向调控自身免疫性疾病的发生发展。

本实验采用不同浓度的牛黄胆酸钠逆行胰胆管注射建立急性轻型胰腺炎、急性重症胰腺炎大鼠模型,该方法是急性胰腺炎造模较成熟的方法。实验中,急性轻型胰腺炎造模12 h后胰腺出现坏死,出现少量腹水,颜色发白;而急性重症胰腺炎造模12 h后胰腺组织坏死明显,腹水较多,胰腺与周围组织发生粘连,胃组织中积水较多,胰腺组织呈紫色,胰腺病理评分较轻型胰腺炎明显升高;结合各实验组血清淀粉酶水平较对照组均升高3 倍以上,IL-10 与TREM-1水平均有不同程度的升高,以上表现与临床及文献报道均相符[15],表明本实验中不同病情的急性胰腺炎大鼠模型建立成功。本实验通过检测急性重症胰腺炎24 h IL-10水平,结果提示IL-10 水平明显升高,说明IL-10对判断早期急性胰腺炎病情严重程度有一定帮助。然而,本实验并未检测48 h甚至72 h急性胰腺炎不同病情下IL-10含量,故本实验结果仍存在一定局限性。随着病情的加重,血清淀粉酶、IL-10、TREM-1 水平明显升高,且与胰腺组织病理学评分呈正相关,说明血清淀粉酶、IL-10、TREM-1有可能对评估急性胰腺炎病情、判断疾病转归有一定的帮助。另外,本实验中,不同病情、不同时间点的大鼠血清IL-10及TREM-1水平比较,SAP组水平明显高于MAP组,其可能通过抑制过度的免疫反应,对急性胰腺炎有一定的保护作用。

综上所述,急性胰腺炎大鼠血清中IL-10、TREM-1水平升高明显,而IL-10、TREM-1水平与疾病严重程度有一定的相关性,且IL-10、TREM-1水平与胰腺组织病理学评分呈正相关,通过对以上指标的检测,本实验有助于临床工作中对急性胰腺炎患者的发病机制、病情严重程度的评估,为早期治疗指出了新的方向。