α-硫辛酸在衰老大鼠听皮层线粒体氧化损伤中的作用

易志富龚鑫 杨双丹

广州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科（广州510120）

听皮层位于听觉中枢通路的终端，是听觉感知的最高级中枢。老年性聋又称为年龄相关性听力损失(age-related hearing loss，AHL)，是导致老年人交流障碍的常见原因，在临床上尚无特效药物治疗。随着老龄化的到来，老年性聋患者数量将会大量增长[1,2]，研究老年性聋的病因及治疗手段变得愈为紧迫。

本研究利用D-半乳糖（D-galactose,D-gal）诱导的衰老大鼠模型[3-5]，实验观察氧自由基清除剂α-硫辛酸（α-lipoic acid，α-LA）[6-8]对衰老大鼠听皮层线粒体氧化损伤及线粒体超微结构的影响，从而探究α-硫辛酸治疗中枢性老年性聋的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级48只4周龄雄性SD大鼠，体重61g～75g，由广州医科大学实验动物中心提供。动物室环境：室内相对温度（23±1）℃，相对湿度（50±10）%。所有动物处死时均无中耳炎。所有实验动物随机分为3组（n=16）：① 对照组（NS）：腹腔注射生理盐水500mg.(kg.d)-18周后，腹腔注射生理盐水40mg.(kg.d)-18周；② 衰老组（D-gal）：腹腔注射D-半乳糖500mg.(kg.d)-18周后，腹腔注射生理盐水40mg.(kg.d)-18周；③ 干预组（α-LA）：腹腔注射D-半乳糖500mg.(kg.d)-18周后，腹腔注射α-硫辛酸40mg.(kg.d)-18周。实验大鼠麻醉方式：肌肉注射氯胺酮（30mg/kg）和氯丙嗪（15mg/kg）麻醉。

1.2 材料与试剂

D-半乳糖购自美国sigma公司，8-OHdG购自美国Abcam公司。H2O2、T-SOD、ATP、MMP检测试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 电镜观察线粒体超微结构

各实验组选取4只大鼠，麻醉后经心脏快速灌注生理盐水，冲净血液后断头处死，取出颞叶听皮层组织，2.5%戊二醛下固定至少2h。0.1M PBS清洗20min×4次，使用1%锇酸后固定2 h，0.1M PBS清洗15min×5次。听皮层组织行梯度脱水。浸入丙酮对半稀释的低黏度包埋剂2h，再用低黏度包埋剂37℃烤箱渗透2h。于低黏度包埋剂中70℃烤箱内包埋8h。进行修块，确保上下面平行，行超薄切片。枸橼酸铅与醋酸双氧铀双重染色，电镜下观察线粒体形态结构，拍照记录。

1.4 线粒体功能指标检测

各实验组选取4只大鼠，快速分离双侧颞叶听皮层组织，加入裂解液，冰上匀浆。裂解后4℃12000g离心5min，取上清，用于ATP含量测定。用ATP检测试剂盒测定ATP含量。用组织线粒体分离试剂盒直接提取颞叶听皮层组织的线粒体，并采用MMP检测试剂盒测定MMP水平。

1.5 免疫组化分析

用免疫组织化学方法分析了DNA氧化损伤的生物标志物8-羟基脱氧鸟苷。16只大鼠（每组4只）的大脑在4℃下用4%多聚甲醛缓冲液固定过夜，脱水，最后包埋在石蜡中。依冠状位切片，厚度约5μm。在二甲苯中脱蜡后，通过梯度浓度的乙醇进行再脱水。脱水后，加入COX IV（1:100稀释）与8-OHdG（1:200稀释）一抗4℃过夜。次日用PBS冲洗3次，每次3min；加入羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗（稀释1:500）室温下孵育1h。继而PBS冲洗3次，每次3min，用DAPI染色液复染细胞核。拍照采图。

1.6 抗氧化指标检测

对12只大鼠（每组4只）的双侧颞叶听皮层组织进行快速分离，加入裂解液，冰上匀浆。裂解后4℃12000g离心5分钟，取上清，用于测定H2O2与T-SOD。H2O2检测试剂盒测定H2O2含量。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；配制WST-8/酶工作液，加入反应启动工作液，37℃孵育30分钟，在450nm波长处测定吸光度，T-SOD检测试剂盒测定T-SOD活性水平。

1.7 统计学方法

由SPSS16.0软件行数据分析，所有实验数据以均数±标准差表示，进行多因素方差分析，确定差异的显著性。

2 结果

2.1 α-硫辛酸对线粒体结构的影响

与对照组相比，衰老组听皮层神经元细胞结构破坏明显，线粒体体积肿胀，线粒体嵴消失，基质出现透明化，甚至出现空泡，干预组线粒体的超微结构，相较衰老组改善明显（图1）。

图1 听皮层神经元细胞的超微结构（3000×）。NS：对照组；D-gal：衰老组；α-LA：干预组。N：细胞核；M：线粒体。标尺=0.5μm。Fig.1 Ultrastructure of neuron cells in auditory cortex（3000×）.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.N:nuclei;M:mitochondrion.Scale=0.5 μ M.

2.2 α-硫辛酸对线粒体功能的影响

对照组、衰老组与D-半乳糖+α-硫辛酸组大鼠听皮层组织的水平分别为12.80±1.90 nmol/mg protein、6.25±1.53 nmol/mg protein与 8.99±0.42 nmol/mg protein，衰老组显著低于对照组（F=6.5785,P＜0.001），而干预组显著高于衰老组（F=3.6731,P=0.017）（图2A）；对照组、衰老组与 干预组大鼠听皮层线粒体膜电位水平分别为6.13±1.25、3.41±0.29与5.02±1.38，衰老组显著低于对照组（F=5.8196,P＜0.001），而干预组显著高于衰老组（F=3.5402,P=0.022）（图2B）。

图2 （A）各组ATP含量；（B）各组MMP水平。NS：对照组；D-gal：衰老组；α-LA：干预组。*P＜0.05，**P＜0.01。n=4。Fig.2 (A)the content of ATP in each group;(B)membrane potential level of mitochondria in each group.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.*P＜0.05,**P＜0.01.n=4.

2.3 α-硫辛酸对DNA氧化损伤的影响

衰老组听皮层组织含有大量的8-OHdG，且绝大部分与绿色的线粒体重合，提示8-OHdG的表达主要发生在线粒体,衰老组显著高于对照组（F=11.918,P＜0.001），而干预组显著低于衰老组（F=7.3322,P=0.001）（图3A、B）。

图3 （A）红色荧光标记8-OHdG，绿色荧光标记线粒体，蓝色荧光标记细胞核；（B）8-OHdG的定量分析。NS：对照组；D-gal：衰老组；α-LA：干预组。标尺=20μm。**P＜0.01。n=4。Fig.3 (A)red fluorescence labeled 8-OHdG,green fluorescence labeled mitochondria,blue fluorescence labeled nuclei;(B)quantitative analysis of 8-OHdG.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.Scale=20μM.**P＜0.01.n=4.

2.4 α-硫辛酸对氧化应激水平的影响

对照组、衰老组与干预组听皮层H2O2水平分别为13.09±1.23mmol/g protein、29.70±3.40mmol/g protein和18.60±1.13mmol/g protein，衰老组显著高于对照组（F=14.407,P＜0.001），而干预组显著低于衰老组（F=8.9269,P＜0.001）（图4A）；对照组、衰老组与干预组听皮层组织的T-SOD活性水平分别为 155.02±19.15U/mg protein、69.80±8.76U/mg protein和113.89±10.56U/mg protein，衰老组显著低于对照组（F=6.0503,P＜0.001），而干预组显著高于衰老组（F=4.6712,P＜0.001）（图4B）。

图4 （A）各组大鼠听皮层H2O2水平；（B）各组大鼠T-SOD活性水平。NS：对照组；D-gal：衰老组；α-LA：干预组；**P＜0.01；n=4。Fig.4 (A)Levels of H2O2in the auditory cortex of rats in each group;(B)Levels of T-SOD activity in the rats in each groups.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group;**P＜0.01;n=4.

3 讨论

据报道，D-gal注射可引起全身各系统氧化应激和线粒体损伤[3-5]，类似于自然衰老大鼠所发生的改变。因此，D-gal已被用作衰老和抗衰老研究的动物衰老模型[9]。α-LA具有干预性保护衰老过程中外周听觉系统氧化损伤的作用[5]，但α-LA对衰老过程中中枢听觉系统氧化损伤的影响尚未有探究。所以我们利用D-gal诱导的衰老模型研究α-LA在衰老大鼠听皮层线粒体氧化损伤中的作用。

已有研究表明氧化应激是导致老年性聋发病的重要因素[10-14]。机体活性氧簇（reactive oxygen species，ROS)的生成与清除失衡，进而导致组织氧化损伤。膜脂质、线粒体、蛋白、核基因均可被活性氧簇破坏，继而损害细胞生理功能。在本研究中，我们发现：在衰老大鼠听皮层组织中，具有抗氧化作用的T-SOD显著下降，且H2O2含量明显增加，再次表明氧化应激增加是导致老年性聋发病的重要因素。

氧化应激会引起线粒体功能障碍。线粒体在体内产生超过90%-95%的ATP,同时产生活性氧簇。随着老化，机体抗氧化能力减弱，导致机体内大分子物质遭到破坏，导致凋亡增多[15,16]。在老化大鼠中，外周[3]及中枢听觉系统[4]出现抗氧化失衡，继而引起线粒体结构破坏。通过本研究亦发现，与对照组比较，衰老组大鼠听皮层H2O2含量明显上升，T-SOD显著下降，机体抗氧化失衡，表明利用D-半乳糖可导致大鼠听皮层氧化应激增加；衰老组大鼠听皮层组织中ATP和MMP显著下降，而DNA氧化损伤标记物8-OHdG在线粒体中的表达显著上升，表明在D-半乳糖诱导的衰老大鼠听皮层组织中线粒体功能出现紊乱[4]。这些研究表明氧化应激损伤及线粒体功能障碍可能是导致老年性聋发病的重要因素。

α-LA是一种强抗氧化剂，兼具脂溶性与水溶性。α-LA具有多种抗氧化功能，可直接清除活性氧，减少炎症反应，抑制活性氧自由基产生[17,18]。另外有研究发现，α-硫辛酸能够缓解线粒体损伤[19]。本研究证实：α-LA可显著降低听皮层组织线粒体DNA和氧化损伤水平，增加ATP和MMP水平，改善线粒体功能，保护线粒体超微结构。因此，α-LA具有干预性保护衰老过程中听皮层组织氧化损伤的作用。