叶酸缺乏的小鼠胚胎干细胞ES-D3中miR-302a、Bcl2L11表达观察及其靶向关系预测和验证

梁燕，曹丁丁，李媛媛，刘卓，吴建新

1 山东第一医科大学附属省立医院，济南250021；2 首都儿科研究所

胚胎发育是一个复杂的过程，受到遗传与环境的交互调控，但胚胎发育过程中的具体作用机制目前仍未明确。我们前期研究[1～3]发现，叶酸缺乏可导致小鼠胚胎干细胞特异性凋亡增加，引起G0/G1期阻滞，微小RNA302a(miR-302a)可能在其凋亡过程中发挥关键作用。无叶酸培养96 h的小鼠胚胎干细胞中Caspase-3表达升高，但凋亡的具体作用机制目前仍未明确。Bcl2L11 (Bcl-2 interacting mediator of cell death) 作为 Bcl-2 家族中仅包含 BH3 的亚家族成员，是一种重要的凋亡调节蛋白[4]。关于Bcl2L11是否参与叶酸缺乏致小鼠胚胎干细胞凋亡过程，是目前的研究热点。2018年6月～2020年5月，我们观察了叶酸缺乏的小鼠胚胎干细胞miR-302a及Bcl2L11 的表达变化，对胚胎干细胞凋亡中miR-302a、Bcl2L11的靶向关系进行预测和验证，旨在为今后研究营养物质在早期胚胎发育中的作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 小鼠胚胎干细胞系ES-D3为本实验室冻存,培养方法同前期研究[1, 2]。DMEM高糖无叶酸培养基购自北京思赛因公司；L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、丙酮酸钠、胎牛血清、胰酶替代品、DPBS均购自Invitrogen/Gibco公司；明胶粉末购自Amresco公司；重组小鼠白血病抑制因子(rmLIF)购自Millipore公司；哺乳动物蛋白提取试剂盒、总RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生物有限公司；cDNA逆转录试剂盒购自Promega公司。丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)购自北京干细胞库；Bcl2L11、β-actin抗体购自Cell Signal Technology公司；引物购自上海捷瑞生物有限公司；……