土霉素对斜生栅藻的毒性效应研究

武鹏鹏，王雅学，沈洪艳,*

1. 河北科技大学环境科学与工程学院，石家庄 050018 2. 河北省药用分子化学重点实验室，石家庄 050018

四环素类抗生素是目前使用量最大的一类人畜共用药物，每年用量占中国抗生素使用总量的14%左右[1-2]。四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，被大量用于促进动物生长的促进剂及人和动物的感染性疾病的治疗[3-5]。土霉素是其中使用量最大的一种，被添加到家畜饲料中预防疾病和促进家畜生长。抗生素类药物在动物体内很难吸收，30%～90%通过动物尿便以母体或代谢产物的形态排出体外后进入环境中[6]。由于四环素类抗生素过量使用，在环境中出现了“假持久性”现象，并引起了一系列的生态环境污染问题[7]。Kümmerer[8]发现人或动物体排出的大量抗生素通过各种途径最终进入水环境，并对水生生物造成危害[9]。有研究表明，美国地表水中土霉素检出浓度为340 ng·L-1[10]，巴西水产水域中土霉素检出浓度为14～7 993 ng·L-1 [11]，我国水体中抗生素检出浓度已达到μg级甚至mg级[12-13]，安徽汪洋河水体中土霉素检出浓度为3.6×105ng·L-1[14]。

很多学者研究了土霉素的毒性效应，土霉素对鱼腥藻和铜绿微囊藻的生长繁殖具有一定的抑制作用，6～90 mg·L-1的土霉素对铜绿微囊藻的叶绿素a表现为抑制作用，且浓度越高抑制作用越强[15-16]。赵素芬和曹日波[17]研究了不同浓度土霉素对湛江等鞭金藻的细胞数量、叶绿素含量和类胡萝卜素含量的影响，发现0～10 mg·L-1的土霉素随着浓度的增加，金藻的细胞数量在生长期增幅越小，在衰退期衰退越快，且叶绿素a含量越少，而类胡萝卜素含量增加。田智宇等[18]发现，当土霉素废渣中含量为25～50 mg·kg-1时，对黄瓜种子发芽和幼苗生长有促进作用，超过100 mg·kg-1对黄瓜种子和幼苗表现出显著性抑制作用。土霉素废水对斑马鱼会造成氧化损伤，并进一步损伤DNA[19-20]。斑马鱼暴露于青土霉素废水时，斑马鱼超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)发生了显著性变化，在第8天斑马鱼受到了明显的氧化损伤[21]。因此，土霉素的生态环境效应需进一步关注。

单细胞藻类是水生生态系统食物链的起点，对整个生态系统影响较大，并且具有易获得、繁殖快和对环境敏感等特点，被广泛应用于毒理学试验，其中，斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)是国际化标准组织(ISO)认可的试验模式生物之一，也是我国环境监测试验藻种[22]，所以，学者们把斜生栅藻应用于对抗生素毒理学研究中，通过暴露实验，从斜生栅藻的生化指标变化情况来衡量抗生素的毒性效应。

本研究，以土霉素为试验对象，以斜生栅藻为模式生物，通过研究土霉素对斜生栅藻生长抑制以及对叶绿素a含量、SOD活性、MDA含量和活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量的影响，来探究土霉素对斜生栅藻的毒性效应机制，为评估土霉素对藻类的环境风险提供一定的科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

土霉素(oxytetracycline dihydrate)购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS6153-64-6，纯度为97%，分子式为C22H24N2O9·H2O。

取适量土霉素，溶解在BG-11培养基中，搅拌使其充分溶解以获得1 g·L-1的母液，用倍数稀释法稀释母液以获得土霉素工作溶液(0、2、4、10、20和40 mg·L-1)备用。

本实验选用的斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)株系购买自中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-12。实验期间严格按照经济合作与发展组织(OECD)发布的OECD 201藻类生长抑制实验方法中的暴露实验质量控制措施进行，要求实验进行无菌操作，将斜生栅藻培养在人工气候培养箱(PRX-250B，宁波赛福实验仪器有限公司，中国)中，温度(25±1) ℃，湿度60%，光照强度为12 000 LX，光照周期为14 h昼∶10 h夜，每天人工摇荡至少3次，多次反复接种，使其处于对数生长期。

1.2 实验方法

在无菌条件下，按照OECD 201藻类生长抑制实验方法，选取生长状态良好的斜生栅藻进行实验，初始藻液浓度为1×106个·mL-1，实验溶液由藻液和土霉素工作溶液配制(V藻液∶V工作溶液=1∶1)，最终实验溶液浓度为0、1、2、5、10和20 mg·L-1，每个浓度设3个平行组。

1.2.1 藻细胞生长量的测定

本实验建立了斜生栅藻细胞密度与吸光度之间的线性方程，拟合优度R2>0.99，将藻细胞暴露在不同浓度的土霉素中96 h，每24小时测定各浓度组在685 nm处的吸光度，进而获得藻密度。

1.2.2 叶绿素a含量的测定

各浓度组取5 mL藻液，6 000 r·min-1离心15 min，并用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mol·L-1，pH=7.3)清洗3次，去除上清液，加入5 mL体积分数为95%的乙醇在75 ℃水浴锅中水浴3 min。再次离心后用紫外分光光度计测定在665 nm和649 nm处吸光度，并依据公式进行计算[23]：

ca=13.95A665-6.88A649

1.2.3 粗酶液的提取

各浓度组取10 mL藻液，6 500 r·min-1离心15 min，用预冷的PBS清洗3次，用10 mL PBS再次悬浮藻细胞，在冰水浴下用超声波细胞破碎仪(BILON92-IIDL，上海比朗仪器制造有限公司，中国)破碎10 min，设置功率95%，工作8 s，间隔3 s，细胞破碎后，在4 ℃下以10 000 r·min-1离心10 min，上清液为粗酶液。

1.2.4 ROS、SOD和MDA的测定

ROS采用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)活性氧探针，用多功能酶标仪(Synergy H1，美国伯腾仪器有限公司)在激发波长485 nm、发射波长525 nm下测定；SOD采用黄嘌呤氧化酶法[24]测定；MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[25]测定；以上测定均严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作。

1.2.5 数据处理

统计结果用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示。用SPSS 24对数据进行单因素方差分析(One-way Anova)，并进行显著性差异分析及t检验，P<0.05，表示差异显著，使用Origin 2017绘图。

2 结果(Results)

2.1 土霉素对斜生栅藻生长的影响

通过血球计数板计数得斜生栅藻细胞浓度(y)与其在685 nm下测得的吸光度(x)的线性回归方程为y= 78.398x-9.257(R2= 0.9956)。用不同浓度的土霉素分别处理藻液，以藻细胞密度为纵坐标，暴露时间为横坐标绘制生长曲线，如图1所示。

图1 土霉素对斜生栅藻生长的影响Fig. 1 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the growth of Scenedesmus obliquus

由图1可知，在所测浓度范围的土霉素的胁迫下，各浓度组斜生栅藻生长均受到抑制作用，并且随着时间的延长，生长抑制越明显；斜生栅藻在96 h生长抑制最为严重，1、2、5、10和20 mg·L-1的土霉素对斜生栅藻的抑制率分别达到了15.5%、17.8%、25.8%、25.7%和44.4%。经SPSS软件计算可知，土霉素对斜生栅藻96 h半数效应浓度(96 h-EC50)为21.3 mg·L-1，无可见效应浓度(NOEC)为2 mg·L-1，最低可观察效应浓度(LOEC)为5 mg·L-1。

2.2 土霉素对斜生栅藻叶绿素a含量的影响

叶绿素a是植物进行光合作用的重要参数之一，植物通过光合作用产生自身需要的能量和有机物，其浓度变化能够直接影响植物生物量的变化，并且可以间接反映植物生长繁殖情况[26]。图2为土霉素对斜生栅藻叶绿素a含量的影响，由图2可知，土霉素对斜生栅藻叶绿素a含量的影响与其对斜生栅藻生长的影响呈现相似的变化规律，96 h内，随时间延长，各浓度组叶绿素a含量均有增长，但随暴露浓度的增加，叶绿素a受到的抑制作用也越来越明显，表现出了一定的剂量-效应关系。24 h时，各浓度组与对照组相比，叶绿素a含量无明显差异；72 h时，1 mg·L-1和2 mg·L-1浓度组表现出了短暂的促进作用；在96 h时，2 mg·L-1浓度组与对照组相比表现出了显著性差异(P<0.01)，5、10和20 mg·L-1浓度组表现出了显著抑制(P<0.001)，叶绿素a含量分别下降了24.2%、21.7%和28.9%。

2.3 土霉素对斜生栅藻SOD活性的影响

SOD属于金属酶，是唯一以自由基为底物的抗氧化酶，在清除过量活性氧自由基、控制膜脂质过氧化水平及减轻膜氧化损伤过程中，发挥着至关重要的作用[27-28]。土霉素对斜生栅藻SOD活性的影响如图3所示，各浓度组斜生栅藻SOD活性与对照组相比，除1 mg·L-1浓度组略微升高外，其他浓度组均表现为抑制作用；1 mg·L-1浓度组达到实验期间最大值675.96 U·mg-1prot，2、10和20 mg·L-1浓度组实验期间受到显著抑制(P<0.05)，20 mg·L-1浓度组达到最低值，比对照组低38.8%。这可能是由于10 mg·L-1和20 mg·L-1的土霉素对斜生栅藻造成了严重的氧化损伤，并且抑制了SOD酶的合成。

图3 土霉素对斜生栅藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响注：字母相同表示不同浓度组间差异不显著，字母不同表示不同浓度组间差异显著；下同。Fig. 3 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the superoxide dismutase (SOD) activity of Scenedesmus obliquusNote: The same letters indicate no significant difference among different concentration groups; different letters indicate significant differences among different concentration groups; the same below.

2.4 土霉素对斜生栅藻MDA含量的影响

MDA是自由基与生物膜中的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, P-UFA)发生脂质过氧化作用形成的脂质过氧化物[29]；它可与生物膜上的蛋白质氨基酸残基或核酸反应生成席夫碱，降低生物膜的稳定性[30-32]。MDA含量可以反映出膜脂的过氧化程度，也是反映生物氧化损伤的代表性指标[33]。土霉素对斜生栅藻MDA含量的影响如图4所示。MDA含量随着土霉素浓度的增加呈现出上升的趋势；1 mg·L-1和2 mg·L-1浓度组与对照组相比MDA含量无显著性差异，这表明斜生栅藻的抗氧化系统能够清除该浓度下土霉素的氧化胁迫；5、10和20 mg·L-1浓度组与对照组相比MDA含量受到了显著性诱导(P<0.05)，MDA含量分别为对照组的1.5倍、2.2倍和3.2倍，表明斜生栅藻细胞已经受到了一定程度的氧化损伤。

图4 土霉素对斜生栅藻丙二醛(MDA)含量的影响Fig. 4 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the malondialdehyde (MDA) content of Scenedesmus obliquus

2.5 土霉素对斜生栅藻ROS的影响

ROS是分子氧在还原过程中的一系列中间产物，其生成和清除在正常生命过程中维持着动态平衡，细胞内的ROS被控制在很低水平，在抗菌消炎方面起着重要作用[34]。但当外源污染物入侵时，ROS生成快速增加，导致氧化应激和抗氧化系统平衡失调，造成细胞氧化损伤[35]。土霉素对斜生栅藻ROS的影响如图5所示。1 mg·L-1和2 mg·L-1浓度组与对照组相比ROS无显著性变化(P>0.05)，表明细胞内抗氧化酶大量合成，抵消了大部分过量的ROS；5 mg·L-1浓度组与对照组相比ROS受到显著抑制(P<0.05)，可能是由于藻细胞内抗氧化酶为抵消氧化应激，过量消耗了ROS；10 mg·L-1浓度组与对照组相比无显著性差异，但ROS水平略微偏高；20 mg·L-1浓度组与对照组相比ROS受到显著性诱导(P<0.01)，ROS水平为对照组的1.2倍，表明土霉素在藻细胞膜内产生了大量的ROS，并对藻细胞造成氧化损伤，藻细胞无法合成足够的抗氧化酶来清除过量ROS。

图5 土霉素对斜生栅藻活性氧(ROS)的影响Fig. 5 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the reactive oxygen species (ROS) of Scenedesmus obliquus

3 讨论(Discussion)

在本实验中，不同浓度的土霉素暴露对斜生栅藻表现出了一定的“剂量-效应”和“时间-效应”关系。本实验所设定土霉素浓度对斜生栅藻均表现出抑制作用，并且随着时间的延长，土霉素对斜生栅藻的抑制作用越明显，余彬彬等[36]将玉米幼苗暴露于土霉素时发现了同样的现象，各浓度组中土霉素对玉米幼苗总根长均表现为抑制作用；刘永涛等[37]用不同浓度的强力霉素处理斜生栅藻时发现，在2 mg·L-1浓度组表现为促进作用，高于2 mg·L-1浓度组表现为抑制作用，许多学者发现抗生素具有“Hormesis”现象[38]，本研究未发现此现象可能是因为土霉素毒性比强力霉素强，只有当土霉素浓度非常低时才会出现“促进”现象发生。本实验结果表明，随着土霉素浓度的增加，斜生栅藻受到的生长抑制作用越明显，20 mg·L-1土霉素表现为显著性抑制，张迪等[7]研究金霉素及其异构体降解产物对斜生栅藻毒性时，也发现了明显的“剂量-效应”关系，抗生素对细胞壁、细胞膜结构具有一定的破坏能力[39-40]，可能土霉素浓度越高对斜生栅藻细胞壁和细胞膜会造成更大的损伤。已有报道显示，土霉素对铜绿微囊藻的96 h-EC50为7.2 mg·L-1 [41]，对小麦种子的EC50为54.2 mg·L-1 [42]，本研究中土霉素对斜生栅藻96 h-EC50为21.3 mg·L-1。

叶绿素a是叶绿素中的重要组成部分，叶绿素a的含量可以直接反映藻细胞的光合作用效率，并且与藻细胞量呈正相关[43]。吴妹英[16]在研究土霉素对铜绿微囊藻繁殖的影响时发现，铜绿微囊藻的叶绿素a含量与生长量变化一致。鲍洁等[44]研究盐酸恩诺沙星对斜生栅藻的影响时，也发现叶绿素a含量与生物量有相同的关系，且叶绿素a在污染物胁迫下受到抑制作用。本研究得到了相似的结果，斜生栅藻在土霉素的胁迫下，叶绿素a受到了明显的抑制作用，对比生长曲线可知，叶绿素a含量与藻细胞浓度呈现正相关关系；这可能是由于土霉素损害了藻细胞膜结构及胞内叶绿体等细胞器，从而影响了光合色素的合成，斜生栅藻光合作用降低，从而抑制藻细胞繁殖[45]。

图6为机体氧化指标关系图，正常机体内自由基的代谢处于动态平衡状态[46]，但当受到污染物入侵时，机体内ROS会大量生成，SOD是避免机体受到氧化损伤的第一道防线，SOD可以催化氧自由基反应生成H2O2和O2[47]，之后再经过其他抗氧化酶作用进一步消除，当机体的抗氧化系统无法清除过量ROS时，就会造成机体的氧化损伤，发生脂质过氧化反应生成MDA。本研究中，斜生栅藻在土霉素的胁迫下，ROS水平随着浓度增加而升高，藻细胞抗氧化系统无法完全清除高浓度土霉素(10 mg·L-1和20 mg·L-1)胁迫下机体产生的自由基，造成SOD活性降低，这也可能是藻细胞受到氧化损伤导致无法正常合成SOD；因此，过量的ROS造成了斜生栅藻MDA含量的升高；张迪等[7]研究金霉素对斜生栅藻的影响时发现了同样的规律，并得出SOD与ROS呈现正相关关系，沈洪艳等[48-49]分别用诺氟沙星和环丙沙星处理锦鲤，也同样发现了随着暴露浓度的升高，SOD活性受到了抑制，而随着暴露浓度的升高，MDA受到了诱导作用。喻燚等[50]研究4-壬基酚对拟柱胞藻影响时，发现SOD活性变化规律与本研究相反，这可能是由于4-壬基酚对拟柱胞藻毒性较小，未造成胞内损伤，为应对氧化应激，促进了藻细胞合成SOD。

综上所述，土霉素对斜生栅藻生长及光合作用水平具有明显抑制作用；10 mg·L-1和20 mg·L-1土霉素造成藻细胞ROS水平升高，大量消耗SOD，且造成了细胞氧化损伤，导致SOD合成受阻，从而活性降低，过量ROS也造成了细胞生物膜的膜脂质过氧化，使得MDA含量升高。因此，10 mg·L-1和20 mg·L-1土霉素会对斜生栅藻造成氧化损伤，具体致毒机制需要进一步研究。

图6 氧化指标关系图Fig. 6 Relationship diagram of oxidation index

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