乌鲁木齐市宠物犬、猫粪源大肠杆菌耐药性分析与ESBLs基因型检测

佟盼盼 杨银萍 谢金鑫 张萌萌 张 凌 唐雪林 张 毅 芦 星 苏战强

(新疆农业大学 动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

我国宠物的拥有数量呈逐年增长趋势，据《2019年中国宠物行业白皮书》(消费报告)数据显示：预测到2024年，我国宠物犬、猫拥有数量达2.48亿只，犬、猫俨然成为伴侣动物中的主流。研究表明犬、猫已成为致人类肠道和肠外感染的大肠杆菌的储存库[1]。由于宠物临床的不规范用药导致大肠杆菌的耐药性日趋严重[2]，甚至出现了对β-内酰胺类抗生素耐药的现象[2-3]。β-内酰胺类抗生素应用广泛，属于一线抗菌药物，大肠杆菌对该类抗生素耐药主要依赖于质粒介导的β-内酰胺酶，其中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)受到广泛关注[3-4]。

宠物携带耐药大肠杆菌不但影响治疗效果，且潜在从宠物传播到人类的风险[2-3,5]。目前，国外已报道宠物可将耐药大肠杆菌传染给人类，严重威胁人类的健康[3,6]。近年来我国广大科研工作者对细菌耐药性及传播机制做了大量的研究，主要集中在食源性大肠杆菌[7-8]，仅有几个省份报道了宠物源大肠杆菌的耐药情况[9-13]，其中很少有关新疆地区宠物源产ESBLs大肠杆菌的分子流行病学数据。因此，本研究旨在对乌鲁木齐市犬、猫源大肠杆菌进行耐药性分析，并对产ESBLs菌株进行β-内酰胺酶基因检测，以期为指导宠物临床合理用药提供理论依据，同时为ESBLs在细菌中的流行病学和进化提供有价值的信息。

1 材料与方法

1.1 样品来源

从2018年9月—2019年6月，从乌鲁木齐市2家宠物医院收集犬、猫肛拭子样品，在采样过程中接受体检和接种疫苗的犬、猫记录为健康宠物；出现体温升高、食欲不振、精神萎靡，伴随呕吐、腹泻等临床症状的犬、猫记录为患病宠物。共采集肛拭子样品181份，包括犬源114份(健康犬33份，患病猫81份)，猫源67份(健康猫19份，患病猫48份)。

1.2 试剂及培养基

抗生素药敏纸片氨苄西林、哌拉西林、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢吡肟、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨苄西林-舒巴坦、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、四环素、复方新诺明、氯霉素、多粘菌素和链霉素购自杭州微生物试剂有限公司；脑心浸液肉汤(BHI)、胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)、麦康凯琼脂(MAC)、MH琼脂(MHA)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；科玛嘉尿道定位显色培养基购自上海欣中生物工程有限公司；质控菌株大肠杆菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603由本实验室保存。

1.3 大肠杆菌的分离鉴定

向装有肛拭子样品的采集管中加入2 mL 0.85%生理盐水，室温震荡混匀10 min，静置3 min，取10 μL混悬液加入BHI培养基中增菌，37 ℃，培养16 h。将增菌液划线接种MAC平板，37 ℃，培养16 h，观察菌落形态，每块平板上挑取疑似大肠杆菌单菌落划线接种科马嘉尿道定位显色培养基平板，37 ℃，培养16 h，取单菌落置于TSB中，37 ℃，培养16 h，利用大肠杆菌16S rDNA特异性引物(F:5’-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3’和R:5’-TCATCCTCTCAGA CCAGCTA-3’，生工生物工程(上海)有限责任公司合成)进行PCR鉴定[14]，阳性菌置于20%甘油的生理盐水中-80 ℃保存备用。

1.4 药物敏感性检测

采用K-B药敏纸片法对宠物源大肠杆菌分离株进行药物敏感性检测。根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2016版执行标准，判定结果为耐药(Resistance，R)、中介(Intermediate，I)或敏感(Susceptible，S)[15]。

1.5 ESBLs表型检测

通过双纸片协同试验检测产ESBLs菌株，同时使用头孢他啶(30 μg)和头孢他啶/克拉维酸(30/10 μg)及头孢噻肟(30 μg)和头孢噻肟/克拉维酸(30/10 μg)2对药敏纸片，当头孢他啶和头孢噻肟中有任何一个，在加克拉维酸后，抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比，增大值≥5 mm时，判定为产ESBLs[15]。大肠杆菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603为质控菌。

1.6 ESBLs耐药基因检测

采用煮沸裂解法提取分离株总DNA作为PCR模板，提取本实验室保存的携带ESBLs耐药基因的菌株总DNA作为PCR阳性对照。根据参考文献[16-19]合成ESBLs耐药基因，包括CTX-M(CTX-M-1G、CTX-M-2G和CTX-M-9G)、TEM和SHV，引物(表1)均由上海生工生物工程有限责任公司合成。PCR反应体系25 μL：Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃再延伸10 min，根据不同扩增基因调整退火温度。

表1 检测耐药基因的引物序列Table 1 Sequences of primers used to screen resistance gens

1.7 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0进行数据分析。单因素分析采用卡方检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 宠物源大肠杆菌的分离鉴定结果

犬、猫肛拭子样品增菌后划线接种麦康凯平板，疑似大肠杆菌呈深桃红色、圆形、扁平，边缘光滑(图1(a))，挑取单菌落在科马嘉尿道定位显色培养基上纯化(图1(b))，经大肠杆菌特异性PCR鉴定(图2)，从181份犬、猫肛拭子中共获得120株(66.3%)大肠杆菌，包括犬源71株，猫源49株。

图1 宠物源大肠杆菌分离株菌落形态Fig.1 Colony morphology of E.coli isolates from pets

M, DNA标记DL 2 000; N, 阴性对照; 1,阳性对照E.coli 25 922; 2～4, 大肠杆菌分离株M, DNA Marker DL 2 000; N, negative control;1, E.coli 25 922 as positive control; 2-4, E.coli isolates图2 宠物源大肠杆菌分离株16S rDNA PCR扩增Fig.2 Amplification of 16S rDNA of E.coli isolates from pets by PCR

2.2 宠物源大肠杆菌的药物敏感性

由表2可知，120株犬、猫源大肠杆菌对19种药物均表现出了耐药性，对四环素、氨苄西林、复方新诺明和哌拉西林的耐药率在35.8%～60.8%；对头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、氯霉素、环丙沙星和多粘菌素6种药物的耐药率在10.0%～29.2%；对亚胺培南、左氧氟沙星、阿米卡星、头孢他啶、氨曲南、氨苄西林-舒巴坦、阿莫西林、头孢吡肟和美罗培南的耐药率在0.8%～10.0%；这些分离株对哌拉西林-他唑巴坦完全敏感。经双纸片协同试验后，35株(29.2%)大肠杆菌为产ESBLs菌株。这些大肠杆菌对链霉素、庆大霉素、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率，患病犬高于健康犬，而患病猫低于健康猫，差异显著(P<0.05)。与患病猫相比，健康猫源大肠杆菌对阿米卡星的耐药率更高。

表2 宠物源大肠杆菌对抗菌药物的敏感性Table 2 Antimicrobial sensitivity of E.coli strains isolated from pets

2.3 宠物源大肠杆菌多重耐药性

20种抗生素包括四环素类、氨基糖苷类、磺胺类、β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类及多肽类共7类。多重耐药的表型定义为同时对≥3类抗生素耐药[20]。宠物源大肠杆菌多重耐药表型的检出率为48.3%(58/120)。如图3所示，犬源和猫源分离株中均存在多重耐药表型，且差异不显著(P>0.05)，犬源分离株主要对3类抗生素产生耐药(16.9%，12/71)，猫源分离株主要对4类抗生素产生耐药(18.4%，9/49)；对6类抗生素耐药菌株的分离率，患病犬显著高于健康犬(P<0.05)，而健康猫显著高于患病猫(P<0.05)。58株多重耐药菌对3～14种抗生素耐药，其中分离自患病宠物的2株大肠杆菌对14种抗生素耐药，与健康宠物相比，患病宠物大肠杆菌的耐药谱型更丰富。在健康和患病犬中均分离到对7类抗生素耐药的菌株，而猫源分离株中不存在这样的菌株。

0R、1R、2R、3R、4R、5R、6R和7R：0、1、2、3、4、5、6和7类结构不同抗菌药物同时耐药；*表示显著差异，P<0.05。0R、1R、2R、3R、4R、5R、6R和7R refer the resistance of E.coli strain to 0,1,2,3,4,5,6, and 7 of different structure antibacterial drugs；*：Significant difference, P<0.05.图3 大肠杆菌分离株多重耐药菌株所占百分比Fig.3 Percentage of multidrug resistant strains of E.coli isolates

2.4 宠物源大肠杆菌ESBLs耐药基因检测

对35株产ESBLs分离株进行β-内酰胺酶基因CTX-M、TEM和SHV检测，如图4所示，22株(62.9%)至少携带一种β-内酰胺酶基因，CTX-M(593 bp)和TEM基因的携带率分别为54.3%(19/35)和34.3%(12/35)，其中CTX-M-1G(1 018 bp)和CTX-M-9G(870 bp)基因携带率分别为40.0%(14/35)和28.6%(10/35)，5株同时检测到CTX-M-1G和CTX-M-9G基因，9株同时携带CTX-M和TEM基因(表3)，未检测到CTX-M-2G和SHV基因。

M, DNA标记DL 2 000; N, 阴性对照; 1, 阳性对照; 2和3, 大肠杆菌分离株M, DNA Marker DL 2 000; N, negative control;1, positive control; 2 and 3, E.coli isolates图4 大肠杆菌分离株β-内酰胺酶基因扩增Fig.4 Amplification of β-lactamase genes of E.coli isolates by PCR

表3 35株产ESBL菌株的β-内酰胺酶基因分型Table 3 Genotyping of β-lactamase gene of the 35 ESBL-producing isolates

3 讨论与结论

3.1 宠物源大肠杆菌的耐药情况

伴侣动物耐药菌的产生和流行受到国内外的广泛关注[9-13,21-23]。近年来从宠物中分离出越来越多的多重耐药大肠杆菌，这些菌携带的耐药基因可在人类和动物之间进行水平传播[22]。成年犬、猫感染致病性大肠杆菌可导致肾盂肾炎和尿道炎，患病犬、猫与人类接触可导致人类发生尿路感染[23]。基于宠物与人类的亲密关系，不仅国外重视研究宠物源大肠杆菌的耐药问题，在我国也有多个地区开展了针对宠物源大肠杆菌的耐药性研究，包括吉林、成都、广州和石河子等[9-12]，大量的研究发现宠物携带有大量的耐药菌，但新疆地区关于此相关研究报道相对较少，因此，本研究对乌鲁木齐市宠物源大肠杆菌进行耐药性研究具有重要意义。

本研究中宠物源大肠杆菌分离株对早期使用较多的抗生素如四环素和氨苄西林的耐药较为严重，与吉林、石河子、广州地区所报道的宠物源大肠杆菌的耐药率相似均在50%以上[9,12-13]。这些分离株对临床常见抗生素，如复方新诺明、哌拉西林、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素等也存在不同程度耐药。在同一类型的抗生素中，如链霉素(27.5%)和阿米卡星(7.5%)的耐药率也存在一定差异。这种情况可能与临床宠物医生抗生素用药习惯及用药频率有关。

本研究发现宠物源大肠杆菌对四环素、氨苄西林、头孢噻肟和环丙沙星的耐药率分别为60.8%、51.7%、29.2%和14.2%，均低于国内其他地区[9,12]。根据宠物医院用药情况发现，目前宠物适用的抗生素种类较多，促使大部分临床宠物医生在用药方面有更多的选择权。国外的研究结果显示，澳大利亚宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药率最高为9.3%，美国宠物源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高达23%；葡萄牙健康犬源大肠杆菌对四环素的耐药率最高为20%[24-26]。与国外相比，乌鲁木齐市宠物源大肠杆菌的耐药率更高，多重耐药情况更严重。此外，从健康和患病宠物中均分离到多重耐药大肠杆菌，与健康宠物相比，患病宠物大肠杆菌的耐药谱型更丰富，宠物临床上应重视监测大肠杆菌的耐药性，慎用耐药率高的抗生素。

3.2 宠物源大肠杆菌ESBLs耐药基因的携带情况

超广谱头孢菌素，尤其是第三和第四代头孢菌素，被世界卫生组织和世界动物卫生组织列为对人类和动物极为重要的抗菌药物[27]。大肠杆菌主要通过产生ESBLs实现对超广谱头孢菌素耐药[4]。在本研究中发现29.2%宠物源大肠杆菌为产ESBLs菌株，高于国内杨守深等[11]对广州宠物的研究结果。本研究在35株耐头孢噻肟的菌株中检测到CTX-M和TEM型ESBLs，检测率分别为 54.3%(19/35)和34.3%(12/35)，以CTX-M型ESBLs为主，且包含CTX-M-1G(40.0%)和CTX-M-9G(28.6%)，这与国内外的研究结果一致[24,28]。13株产ESBL菌株未检测到CTX-M、TEM和SHV，表明这些菌株可能携带其他酶，降低了对三代头孢菌素的敏感性[8]。

碳青霉烯类抗菌药物是治疗革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”。值得注意的是，在药敏试验中，发现有9.2%的宠物源大肠杆菌分离株对亚胺培南耐药，而且在1只幼龄布偶猫体检的肛拭子中分离到1株对美罗培南和亚胺培南同时耐药的菌株，这些菌株的耐药基因有待进一步研究。

综上所述，乌鲁木齐市宠物源大肠杆菌对临床常用抗生素的耐药率在10.0%～60.8%，并出现了对碳青霉烯类耐药的菌株，提示该地区宠物源大肠杆菌耐药情况严重，应重视产ESBLs大肠杆菌在宠物中流行的严峻形势，慎用耐药率高的抗生素，对防止耐药基因在大肠杆菌中的广泛播散具有重要意义。