响应面法优化艾蒿水提物的提取工艺及其抗氧化活性分析

张 晶 邢媛媛 金 晓 徐元庆 红 雷 史彬林

(内蒙古农业大学 动物科学学院，呼和浩特 010018)

艾蒿(Artemisiaargyi)是菊科蒿属中一种多年生常绿草本，喜温湿，多生于荒地林缘，通常情况下，我国除干旱及高寒地带外，其他地区都适宜艾蒿生长。艾蒿不仅能作为传统的中药药材，亦可用于医疗保健、制作食品和动物的绿色饲料添加剂。艾蒿水提物(Artemisiaargyiaqueous extract，AAE)是以艾蒿为原料，通过物理、化学或生物的方法处理后，以水为溶剂进行溶解，浓缩得到含有效成分且其结构完整的提取物。因饲喂AAE对动物体具有无污染、无毒副作用和无残留的特性而被研究学者广泛关注[1]。已证实从艾蒿中提取的挥发油、黄酮、多糖、生物碱和三萜类等活性成分具有抗炎、抗菌、抗衰老、调节免疫、抗氧化和促生长等作用[2-3]。

目前关于艾蒿的提取方法主要有水提法、醇提法、水蒸汽蒸馏法和微波辅助提取法等[2]。其中醇提法虽易于实现工业化生产但提取物中杂质较多[4]；水蒸汽蒸馏法具有便于分离的优点，但缺点也明显：挥发油与水发生水和反应使之变味，不利于饲喂动物，此外，除水仪价格昂贵，且无法降低处理高生物需氧量废水成本[5]；微波法虽然对特定植物成分具有较高提取率，但对植物的细胞结构影响较大易造成溶剂残留，此外，微波设备价格昂贵，不易于实现工业化生产[6]。各提取方法具有鲜明的优缺点，而传统中药提取惯用的水提法，则具有适用范围广，安全系数高，操作简便和经济成本低等优势，更加适用于实际生产需求。此外，各提取方法可据具体要求对其提取工艺的参数进行优化，以达到提高提取率的目的。常见的优化方法有响应面法和正交设计法，其中正交设计选取的代表点并不能完全反应整体情况，且设计结果所得优选值只是试验选用水平的某一种组合，具有局限性，而响应面法将数据进行多项式拟合后，以图形表达函数关系，使其结果更加简单明了，易于发现影响因素之间以及影响因素与提取率的交互关系，所以响应面法广泛应用于优化多因素影响的植物提取工艺[7-9]。综合考虑成本及各方法的优缺点，本研究采用操作简单且成本低廉的水浴恒温加热法对艾蒿进行提取，以单因素分析为基础，用更加科学合理的响应面法优化工艺参数，并评价水提物的抗氧化活性，旨在为科学有效地开发具有抗氧化功效的艾蒿水提物饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试艾蒿：在2018年8月于内蒙古和林格尔县大红城乡境内采集。

试剂：抗坏血酸(Vitamin C，Vc)、过氧化氢(Sigma-Aidarch公司)；磷酸盐缓冲液(Hyclone公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Phygene公司)；无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁和水杨酸等(国药集团化学试剂有限公司)；除DPPH外其余试剂均为分析纯。

仪器：DT-10KA电子天平(常熟市金羊砝码仪器有限公司)； SHZ-88-1水浴恒温震荡器、RE-5298旋转蒸发仪器(上海雅荣生化仪器设备有限公司)；SHB-3循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；ALPHA 1-2LDplus真空冷冻干燥机(德国Marin Christ公司)；TD4Z电动离心机(湖南凯达科学仪器公司)；V-1000可见光分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1艾蒿的前处理

将采集的艾蒿地上部分平铺于室内完全阴干，剪成3～5 cm的小段，将叶子与杆混合均匀用作提取水提物的原料。AAE由各种生物活性成分构成，据前期初步测定，AAE中多糖、黄酮和多酚3种常见的活性成分含量分别为8%～10%、6%～12%和4.32%～6.75%[10]。

1.2.2单因素试验

(1)料液比对AAE提取率的影响：准确称取 40 g 艾蒿，在水浴温度70 ℃的条件下，分别研究不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30(艾蒿质量与水的体积比，下同)对提取率的影响，按比例加入自来水，用保鲜膜封口后，水浴4 h。每组设定3个重复(n=3)。

(2)时间对AAE提取率的影响：准确称取 40 g 艾蒿，在水浴温度70 ℃条件下，以料液比 1∶20 的比例加入自来水，用保鲜膜封口后，分别水浴2、4、6、8、10、12和24 h。每组设定3个重复(n=3)。

(3)温度对AAE提取率的影响：准确称取40 g艾蒿，以料液比1∶20的比例加入自来水，用保鲜膜封口后，控制温度分别为25 ℃、40 ℃、55 ℃、70 ℃、85 ℃和100 ℃，水浴8 h。每组设定3个重复(n=3)。

1.2.3响应面试验设计

利用Design-Expert V8.0.6进行Box-Behnken设计响应面试验，以单因素试验结果为基础，自变量选择料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)，响应值选择AAE提取率(Y)，进行3*3正交试验，每个试验重复3次，3个水平分别采-1、0和1作为编码，如表1。

表1 响应面试验分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4AAE抗氧化活性的测定

(1)铁离子还原力的测定：将不同质量浓度(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36和0.40 mg/mL)的样品溶液和维生素C(Vc)溶液各取2 mL于试管中，依次加入2.5 mL的0.2 mol/L pH=6.6磷酸盐缓冲液和2.5 mL的1%铁氰化钾溶液，充分混匀，50 ℃恒温水浴20 min，流水冷却后加入2.0 mL 10%的三氯乙酸溶液使反应终止，以3 000 r/min离心15 min，吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，振荡摇匀，室温静置10 min，蒸馏水调零，于700 nm处测定吸光度值，每个浓度3个重复取平均[11]。

(2)清除DPPH自由基的能力：吸取1.0 mL已稀释到不同浓度的艾蒿水提液，分别加入2.0 mL的 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，记为Ax；以等量无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，记为Ax0；以等量蒸馏水替换AAE溶液，记为A0；并用Vc做阳性对照，每个浓度3个重复取平均，混匀后避光于室温下反应30 min，离心，用无水乙醇调零，于517 nm波长处取上清测定吸光值[12]。按下式计算AAE对DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100%

(1)

式中：Ax为反应体系吸光度；Ax0为样品本底吸光度；A0为空白对照吸光度。

(3)清除羟自由基(·OH)的能力：吸取 2.0 mL 已稀释到不同浓度的艾蒿水提液，依次加入2.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，摇匀，静置10 min后加入2.0 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，充分振荡混匀，37 ℃ 恒温反应30 min，记为Ax；以等量蒸馏水代替H2O2溶液，记为Ax0；以等量蒸馏水替换AAE溶液，记为A0；并用Vc做阳性对照，每个浓度3个重复取平均，用无水乙醇调零，于波长510 nm处测定所得吸光值[12]。按下式计算AAE对羟自由基(·OH)的清除率：

羟自由基(·OH)清除率=
[1-(Ax-Ax0)/A0]×100%

(2)

式中：Ax为反应体系吸光度；Ax0为样品本底吸光度；A0为空白对照吸光度。

1.3 数据处理

使用 Microsoft office excel 2010进行数据的初步整理和图表的制作，Design-Expert V8.0.6 Box-Behnken设计原理进行响应面表格的制作，GraphPad Prism 6绘制各影响因素间的互作图，最后利用SPSS 16.0进行概率单位分析得出IC50值并且对全部数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素分析

2.1.1单因素料液比对AAE提取率的影响

由图1(a)可知，随料液比的增加，AAE提取率呈先升高后降低的趋势，此结果与前人报道的料液比对蒿属植物魁蒿和艾蒿总黄酮提取量的影响趋势相似[13-14]。当料液比为1∶20和1∶25，提取率到达所测极值且两者间差异不显著(P>0.05)。当料液比较小时，可能由于水溶液已经饱和而无法析出更多的有效成分，造成AAE提取率降低[14]。但随着料液比的增加，艾蒿充分溶于水中，从而AAE提取率也逐步上升。然而料液比过大时，质子推动力会影响AAE中有效成分的溶出，导致提取率有所下降[13]。料液比过高则加大了后期旋转蒸发的工作量，造成了溶剂浪费，故最佳料液比选择 1∶20[4]。

2.1.2单因素时间对AAE提取率的影响

由图1(b)可知，随水浴时间的延长，AAE提取率总体趋于上升，此结果与李杰等[4]研究报道的时间对艾蒿生物碱提取量的影响趋势一致。在8 h到达第一个小高峰，极显著高于2～6 h的提取率(P<0.01)。水浴时间较短时，艾蒿吸收的热能不足，细胞破裂程度较低，溶出的有效成分较少，随着水浴时间延长，艾蒿细胞逐渐破裂，AAE提取率上升。但在10 h时略有降低，随后继续上升。降低的原因可能是由于长时间的水浴影响了AAE中多糖的分子链，对多糖结构造成了破坏，萃取到的有效成分降低，AAE提取率微降，之后被破坏的各种成分也被析出，提取率又上升[16]。因此，水浴时间8 h为宜。

2.1.3单因素温度对AAE提取率的影响

由图1(c)可知，在25～85 ℃范围内，随水浴温度的升高，55 ℃的提取率极显著高于25 ℃和40 ℃(P<0.01)，而55 ℃、70 ℃和85 ℃组间差异不显著(P>0.05)。随着水浴温度的逐渐升高，溶液体系中AAE有效成分多糖的析出导致提取液黏度降低，扩散系数增加，加速分子的运动，提取率快速上升[14]，当提取温度达到55 ℃后，提取率基本不发生太大变化，可能是由于溶剂的挥发，导致有效成分损失，在70 ℃时提取率较高为18.26%。在用超声波法提取蒿属植物的研究结果与本试验类似，75～80 ℃ 时提取率会有下降的趋势[13-14]。当水浴温度100 ℃时达到峰值且极显著高于其余各组(P<0.01)，但溶剂损耗较大，多数热敏成分不耐高温而失活，故选取70 ℃为较佳的水浴温度。

同一图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下图同。Different small letters indicate significant difference between treatments in the same figure (P<0.05). The same as below.图1 料液比(a)、水浴时间(b)和水浴温度(c)对艾蒿水提物提取率的影响Fig.1 Effect of soild-liquid ratio (a), time (b) and temperature (c) on the yield of AAE with water as solvent

2.2 响应面优化设计

2.2.1试验设计与分析

据单因素试验结果，选定液料比(A)、水浴时间(B)和水浴温度(C)为自变量，AAE提取率(Y)为响应值，利用Box-Behnken设计原理进行3因素3水平试验设计，结果见表2。

将表2试验结果进行二次回归拟合，得到AAE的多元回归方程为：Y=18.91+1.97A-0.097B+1.02C-0.34AB-0.19AC-0.019BC-0.18A2-0.78B2-1.74C2。对表2所得数据运用Design-Expert 8.0.6软件进行方差分析，结果见表3。

表2 响应面分析优化Table 2 Optimization of response surface analysis

由表3可知，模型P<0.001极显著，得知模型所得方程与实际数据非常拟合，可用该模型设计试验优化AAE的提取工艺。失拟项P=0.116 8>0.05，差异不显著，说明该试验误差小，模型残差由随机误差产生。决定系数R2=0.942，表明试验值与预测值之间密切相关，即所选变量可影响AAE提取量中94.20%的变化量。一次项料液比和水浴温度对AAE提取率的影响极显著(P<0.01)，但水浴时间差异不显著(P>0.05)；各因素间的互作作用差异也均不显著(P>0.05)；二次项C2水浴温度对AAE提取率的影响极显著(P<0.01)。再根据F分布和P值可知影响AAE提取率的顺序为：液料比(A)>水浴温度(C)>水浴时间(B)。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.2.2因素间的交互作用

3个因素中固定其中1个因素，对另外2个因素进行分析得到响应曲面，曲面越陡峭，说明影响越显著[17]。各因素对响应值的影响结果如图所示，由图可知,响应曲面开口均向下，图3中料液比和水浴温度所得3D曲面较图2与图4相比较陡，但差异仍不显著。当对应等高线为圆形时，表明交互作用为不显著[16]。因此，液料比、水浴时间和水浴温度两者间交互作用均不显著(P>0.05)，此结果与表2所得结果一致。

图2 料液比与时间交互作用的等高线图(a)和响应面图(b)Fig.2 Contour plot (a) and response surface plot (b) showing the effects of solid-liquid ratio and time

图3 料液比与温度交互作用的等高线图(a)和响应面图(b)Fig.3 Contour plot (a) and response surface plot (b) showing the effects of solid-liquid ratio and temperature

2.2.3验证试验

该试验设计优化后的最佳提取工艺条件为：液料比1∶25、水浴时间9.99 h、水浴温度83.61 ℃。结合试验条件的可行性，将实际操作改良为液料比1∶25、水浴时间10 h、水浴温度84 ℃，在此条件下重复3次试验，AAE平均提取率为18.05%(n=3)，与理论预测值18.01%的相对偏差为0.24%且差异不显著(P>0.05)，阐明通过响应面优化后所得参数真实可靠，水浴处理可提高AAE提取含量。

2.3 AAE的抗氧化活性测定

2.3.1AAE的铁离子还原力

铁离子还原力主要是检测三价铁离子被还原为二价铁离子的能力，广泛应用于植物提取物的还原力测定，当测得吸光值越高时，则证实还原力越高，抗氧化活性越高[18]。不同浓度AAE与阳性对照Vc对铁离子还原力的测定见图5(a)，在0.04～0.4 mg/mL 测定范围之内，Vc吸光值在0.12 mg/mL之前先快速上升随后趋于平缓增加状态，样品吸光值随AAE浓度的增大而增大，当样品浓度为 0.4 mg/mL 时，Vc吸光值高达250.25%，而AAE达到最大值122.70%，说明AAE有明显的还原能力，是一种有效的还原剂，但活性弱于同浓度下的Vc。

2.3.2AAE的DPPH自由基清除能力

DPPH的自由基相对稳定，试验操作简单，虽部分溶于水的有效成分会被乙醇析出，造成溶液浑浊吸光值较大，但溶于水的成分比例较低，待反应结束后离心即可减少误差，结果较为准确，是多数学者选择测定体外抗氧化的常用指标[19]。不同浓度AAE与阳性对照Vc对DPPH自由基的清除能力见图5(b)，在0.04～0.4 mg/mL测定范围之内，Vc清除率由0.04 mg/mL的83.04%上升到 0.08 mg/mL 的95.83%时即为最大值，而后基本保持不变。样品清除率为0.04～0.16 mg/mL时呈正相关，随后趋于平稳，当样品浓度为0.28 mg/mL时，Vc清除率高达95.72%，而AAE的清除率达到最大值81.99%，据95%的置信区间可求出AAE和Vc的IC50分别为0.102和0.006 mg/mL，IC50数值越低，则清除率越高，由此得出，AAE对DPPH自由基清除的能力虽不及Vc，但仍然具有较强的清除能力，是一种可供选择的自由基清除剂。

2.3.3AAE的羟自由基(·OH)清除能力

AAE通过抑制·OH的氧化作用，使邻二氮菲-Fe2+无法氧化成邻二氮菲-Fe3+，待测液清澈，使510 nm处的吸光值升高，可间接反应出提取物抗氧化活性的强弱[17]。不同浓度AAE与阳性对照Vc对羟自由基的清除能力见图5(c)，在0.04～0.4 mg/mL测定范围之内，Vc清除率随AAE浓度的增加而增大，呈线性关系，样品清除率在0.32 mg/mL前也呈线性增加趋势，之后缓慢增加至样品浓度为 0.4 mg/mL 时达最大值42.41%，同等浓条件下Vc清除率达到69.11%。据95%的置信区间可计算出AAE和Vc的IC50分别为0.311和0.175 mg/mL。这说明与阳性对照Vc相比，AAE的羟自由基清除率低于Vc，但仍然具有清除自由基的能力，也具备一定的抗氧化活性。

图5 艾蒿水提物铁还原力(a)、清除DPPH自由基(b)和羟自由基(c)能力的测定结果Fig.5 The iron reduction capacity (a), on DPPH (b) and hydroxyl (c) free radical scavenging ability of AAE

3 讨 论

不同提取方法对艾蒿进行提取所得成分和提取率均不同。研究表明，利用醇提法提取艾草生物碱的提取率为0.382 7 mg/g[4]。利用水蒸汽蒸馏法对艾叶挥发油和多糖进行联合提取，提取率分别为0.43%和2.72%[5]。利用微波辅助提取艾草黄酮，其得率较高为4.37%[6]。本研究选用水提法，在单因素试验的基础上，以料液比、水浴时间和温度为自变量，艾蒿水提物的提取率为响应值，进行响应面优化。响应面法是一种可实现提取工艺参数优化的方法，能够考虑影响因素之间的交互作用，将自变量与因变量之间的函数关系以图形展示，不仅使数据更加直观明确，还能提高提取率。本试验结果表明，从最佳提取工艺条件的结果来看，AAE的平均提取率为18.05%。据报道，传统水提法在未优化前的提取率仅为0.50%[20]，在本课题组前期研究中测得最高提取率也只是8.04%[10]，所以本试验所得的AAE提取率18.05%为目前文献报道艾蒿水提工艺方面较高水平，为实现工业化生产AAE饲料添加剂提供参考依据。

本实验室前期研究表明，在肉仔鸡饲料中添加适宜剂量的AAE，可显著提高机体的抗氧化功能[1]。但AAE在体外是否仍然具有很高的抗氧化活性,目前尚未有研究报道。本试验通过检测AAE体外抗氧化活性发现，首先AAE在试验浓度条件下，与铁离子的还原能力呈正相关。本试验中浓度为 0.4 mg/mL 时的AAE与赵文竹等[21]研究中 6 mg/mL 生姜水提取物相比，铁离子还原力相当，表明艾蒿水提物对铁离子还原力的作用效果优于生姜水提物。其次艾蒿水提物对DPPH自由基具有较强的清除能力。研究表明，AAE的DPPH清除能力(IC50=0.102 mg/mL)仅次于五花茶复配水提物(IC50=0.098 mg/mL)和槐花水提物(IC50=0.099 mg/mL)，但略高于菊花水提物(IC50=0.141 mg/mL)和金银花水提物(IC50=0.146 mg/mL)，还是代代花和白扁豆花水提物的7倍[22]。此外，本研究结果与陈胜军等[23]研究结果相比较，DPPH清除能力更是达到舌状蜈蚣藻水提物的124倍之高。最后，本试验结果表明，随样品浓度的增加艾蒿水提物对 ·OH 自由基的清除能力逐步提高，通过与文献中舌状蜈蚣藻水提物(IC50=2.05 mg/mL)和方竹笋废笋渣水提取物(IC50=1.93 mg/mL)相比较，发现AAE(IC50=0.311 mg/mL)对羟自由基的清除能力均明显优于上述水提物[23-24]。综上所述，经过响应面优化，提取率有所提升，且艾蒿水提物是一种有效的体外抗氧化剂。但本研究仍然存在不足之处，提取率与影响因素之间的具体作用关系仍不清楚，因此在后续研究中，将对不同条件下的提取物，测定抗氧化活性，检测各活性成分含量及结构等，为艾蒿资源的高效利用提供理论依据。

4 结 论

本研究以艾蒿为原料，水为溶剂，结合单因素和响应面分析方法，优化艾蒿的水提工艺，确定最佳水提条件为：料液比1∶25，84 ℃水浴10 h。按此条件验证得出AAE提取率为18.05%。随后体外抗氧化试验表明AAE有较强的铁还原力，DPPH和·OH自由基的清除作用，但抗氧化活性弱于Vc，这说明AAE可以作为一种良好的天然抗氧化剂来源，有助于开发艾蒿的潜在价值。