不同部位来源脂肪干细胞促进移植脂肪存活的实验研究*

杨艳清， 陈俊伟， 刘远航， 付 洁， 徐 丹， 江昌艳

武汉市第三医院(武汉大学同仁医院)整形外科，武汉 430060

自体颗粒脂肪移植在整形美容外科领域应用广泛，特别在面部年轻化的治疗方面发挥重要的作用[1-3]。为了促进移植脂肪的存活，临床上在进行自体颗粒脂肪移植时常常加入脂肪干细胞，即干细胞辅助脂肪移植(cell-assisted lipotransfer，CAL)技术[4-5]。脂肪干细胞存在于人体多个部位，本研究观察了分别来自腹部和大腿的脂肪干细胞在体内促进移植脂肪存活方面的差异，为临床选择脂肪干细胞的获取部位提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

脂肪组织取自2015年3月至2017年2月在武汉市第三医院整形外科行脂肪抽吸术的女性患者，共14例，包括来自腹部和大腿的脂肪组织标本各7例。患者年龄19～36岁，平均24.28岁。2组患者年龄差异无统计学意义。上述标本的获取均征得患者本人知情同意。

雌性裸鼠7只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证编号：SCXK(京)2014-0004]，质量15～18 g，4周龄。

1.2 人脂肪干细胞的分离和培养

在无菌条件下分别抽吸获取7例腹部和7例大腿的脂肪组织标本，PBS反复浸泡冲洗，洗净标本上的血液。清洗后加入等体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，恒温水浴锅消化60 min后在低速离心机中以1200 r/min离心6 min。弃除悬浮的脂肪颗粒、脂滴、脂肪细胞和培养液，保留最下层的细胞沉淀。用含有10%胎牛血清(FBS)、1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养液重悬，以1×106/mL的细胞密度接种于75 cm2的培养瓶内，然后放入恒温细胞培养箱中进行培养。收集培养的第3代细胞进行流式细胞仪检测。

1.3 脂肪干细胞辅助脂肪移植模型的制备

收集培养的第3代脂肪干细胞，自体颗粒脂肪均取自腹部。取4周龄雌性裸鼠7只，将裸鼠用2%戊巴比妥钠按照50 mg/kg进行腹腔注射麻醉，然后利用注射器将细胞注射至裸鼠背部皮下。每只裸鼠移植3个部位，一侧为腹部来源脂肪干细胞辅助脂肪移植组(A组)：将数量为1×106/mL腹部来源脂肪干细胞混悬于0.2 mL DMEM培养液中，然后与0.3 mL脂肪细胞混合；对称的另一侧为大腿来源脂肪干细胞辅助脂肪移植组(B组)：将数量为1×106/mL大腿来源脂肪干细胞混悬于0.2 mL DMEM培养液中，然后与0.3 mL脂肪细胞混合；另外一处(背部尾侧端中线处)为阴性对照组(C组)：0.2 mL DMEM完全培养液与0.3 mL脂肪细胞均匀混合。混合后的细胞按照随机原则注射于裸鼠腰背区皮下的3个区域。

1.4 脂肪移植术后观察

脂肪移植术后3个月，对移植的脂肪组织进行观察，包括①移植物组织的细胞鉴定：对分离培养的细胞进行油红O染色观察；②移植物体积测定：术后3个月取材，肉眼观察并测算移植物体积大小(移植物长径×宽径×高×π/6)；③湿重测量：沿移植物包膜外分离，完整取出移植物，用电子天平对其进行湿重测定。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达

本实验选取了FITC荧光素标记的CD13、CD29、CD44、CD45、CD90和CD105单克隆抗体，使用流式细胞仪检测培养的第3代细胞，结果显示，从脂肪组织分离培养的干细胞表达间充质细胞表面标记物CD13、CD29、CD44、CD90和CD105，而不表达造血细胞和内皮细胞表面标记物CD45(图1)。

图1 流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原标记物的表达Fig.1 Expression of cell surface CD markers of ADSCs by flow cytometry

2.2 移植物细胞油红O染色结果

观察分离培养获得的细胞，可见胞质内有少量微小脂滴形成，细胞油红O染色后可见脂滴被染成橘红色(图2)，符合脂肪细胞的细胞学特征。

图2 细胞油红O染色(×400)Fig.2 Cells stained with oil red O staining(×400)

2.3 大体观察

术后3个月，A组脂肪块体积最大，B组脂肪块体积次之，C组移植物体积明显小于其他组(图3)。其中A组移植物体积平均值为(0.065±0.008)cm3，B组移植物体积平均值为(0.032±0.006)cm3，C组移植物体积平均(0.011±0.004)cm3。实验组(A组和B组)移植物体积与阴性对照组的差异均具有统计学意义(均P<0.01)，A组与B组两组间比较，移植物体积差异亦具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 湿重测量

术后3个月，A组和B脂肪移植物湿重分别为(0.201±0.020)g、(0.146±0.070)g，两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

A：腹部来源脂肪干细胞辅助脂肪移植组；B：大腿来源脂肪干细胞辅助脂肪移植组；C：阴性对照组图3 植入术后3个月大体观察图Fig.3 Gross observation 3 months after implantation

3 讨论

Matsumoto等[6]首先提出细胞辅助脂肪移植的概念，脂肪组织来源干细胞在体内可促进游离移植脂肪的存活已得到证实[6-7]。干细胞辅助脂肪移植中脂肪干细胞的作用可能包括：可分化为脂肪细胞并促进脂肪组织再生；可分化为血管内皮细胞，促进血管生成；可释放血管生成因子，诱导移植脂肪周围血管再生等[8-9]。不同部位来源的脂肪干细胞促进血管化的作用不尽相同，前期我们的研究发现：与来自大腿的脂肪干细胞相比较，来自腹部的脂肪干细胞在向血管内皮细胞分化和分泌血管内皮细胞生长因子方面有更多的优势，可能更利于新生血管的形成[10]。干细胞辅助脂肪移植技术也可以改善游离移植脂肪的存活率，脂肪干细胞存在于身体多个部位，不同部位来源的脂肪干细胞在促进体内移植脂肪存活方面有无差异性，是本课题研究的重点内容。

我们分别分离及培养来自腹部和大腿的脂肪干细胞，利用流式细胞仪检测，结果显示，细胞表面出现间充质干细胞特异性标志物CD13、CD29、CD44、CD90和CD105，而不表达造血系的表面标记物CD45，符合间充质干细胞的鉴定标准，且由非造血系细胞分化而来。将培养的第3代脂肪干细胞与取自同一人体的腹部颗粒脂肪混合移植于裸鼠腰背部皮下，然后观察移植物体积和湿重的变化。移植术后3个月，细胞油红O染色后可见脂滴被染成橘红色，符合脂肪细胞的细胞学特征，说明移植存活的组织为脂肪组织。实验观察结果显示：实验组A组(腹部来源脂肪干细胞辅助脂肪移植组)、实验组B组(大腿来源脂肪干细胞辅助脂肪移植组)和阴性对照组脂肪块体积分别是(0.065±0.008)cm3、(0.032±0.006)cm3和(0.011±0.004)cm3。实验组移植物体积明显大于对照组(均P<0.01)，而A组体积又大于与B组，差异亦具有统计学意义(P<0.05)。A组和B组脂肪移植物湿重分别为(0.201±0.020)g和(0.146±0.070)g，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。上述研究结果表明脂肪干细胞可以促进移植脂肪的存活，而且来自腹部的脂肪干细胞可能比来自大腿的脂肪干细胞更易促进腹部脂肪颗粒的存活。

我们的研究中不同部位获取的脂肪干细胞出现促进脂肪存活的差异，这可能与不同部位脂肪干细胞的功能差异有关。这在一定程度上提示我们，在临床利用脂肪干细胞辅助脂肪移植技术时，获取来自于腹部的脂肪干细胞可能更有利于促进腹部颗粒脂肪的存活。由于本研究采集的颗粒脂肪都来自于腹部，如果取来自于大腿的颗粒脂肪，不同部位脂肪干细胞辅助移植时是否也存在存活率的差异性，以及同一部位脂肪干细胞是否更利于同一部位的颗粒脂肪存活，将是我们下一步要研究的问题。