血红蛋白A2在静止型和标准型α-地中海贫血筛查中的价值探讨

王玉霞 戴庆福 林玉梅 卢永芳 曹春芳

地中海贫血（地贫）是由于珠蛋白链合成减少或缺乏所致的一种遗传性溶血性贫血，是我国南方地区最常见、危害最大的单基因遗传病之一，其中广西、广东、海南最为严重[1]，福建亦为地贫高发区[2]。临床上根据珠蛋白肽链受损类别的不同，主要分为α-地贫和β-地贫两种，以α地贫为主，尤其以东南亚缺失型常见[3]。由于中、重型α-地贫患者预后不良，现阶段尚无根治的方法，因此，如何有效开展婚前、孕前筛查及时发现基因携带者和加强产前诊断是防止重型地贫儿出生的有效手段。目前，临床上地贫的诊断主要依赖常规血液分析各红细胞参数，再进行血红蛋白电泳，根据HbA2含量降低或升高初步分为α或β-地贫者，最后进行基因诊断分型。一般认为HbA2含量降低（<2.5%）疑为α-地贫，但静止型和标准型α-地贫患者其含量常出现降低不明显或正常现象，极易导致被漏筛[4-5]。为进一步了解HbA2对α-地贫初筛的效果，本研究对近年来检出的静止型和标准型α-地贫患者的HbA2含量与基因检测结果进行了相关性研究，并对可能影响HbA2检测结果的缺铁因素进行分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年5月-2017年12月，在笔者所在医院进行血液分析、血红蛋白电泳筛查、血清铁蛋白及地贫基因检测的疑为地中海贫血的8 979例患者为研究对象，其中男1 167例，女7 811例，年龄1～90岁，平均（46.56±3.31）岁。疑似地贫患者诊断标准：（1）血细胞分析指标MCV<80 fl或MCH<27 pg；（2）无其他感染性疾病或血液性疾病；（3）无其他严重内科慢性疾病或并发症。地贫缺铁组及对照组纳入标准：（1）通过地贫基因检测确诊为静止型和标准型患者；（2）血清铁蛋白检测结果，男性<30 μg/L，女性<15μ g/L；（3）对照组为血细胞分析指标MCV<80 fl或MCH<27 pg，但地贫基因检测正常且血清铁蛋白检测男性<30 μg/L，女性<15 μg/L。

1.2 仪器与试剂

血细胞分析采用日本Sysmex XT-2001i全自动血细胞分析仪及配套试剂和质控品；血红蛋白电泳HbA2含量测定，采用法国Sebia全自动毛细管电泳分析仪自动扫描系统分析及配套试剂和质控品；血清铁蛋白检测，采用罗氏E601全自动电化学发光免疫分析仪和原装配套进口试剂及质控品；基因扩增采用ABI 2720基因扩增仪，DNA提取及检测试剂均为深圳亚能生物技术公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 标本采集 患者取半坐卧位，在30 s内先后收集患者静脉血4 ml分别置入于EDTA-K2抗凝的紫色真空采血管和内含有分离胶的黄色真空采血管中，立即混匀后送实验室进行血细胞分析、血红蛋白A2含量测定、血清铁蛋白的测定。

1.3.2 血细胞分析 采用XT-2001i全自动血细胞分析仪检测，主要观察指标为MCV、MCH，当患者MCV<80 fl和MCH<27 pg时进行血红蛋白电泳分析，观察血红蛋白A2含量。

1.3.3 血红蛋白电泳（HbA2含量测定） 将采集的静脉血标本以5 000 r/min速度离心5 min，加样枪吸取90 μl溶血素于稀释杯，再加18 μl离心后的红细胞层标本于稀释杯中进行溶血稀释，然后用仪器进行检测。每批样本均同时使用仪器的配套质控品进行质控后，对所有的样本处理结果进行记录。血红蛋白电泳HbA2筛查标准：HbA2<2.5%或出现异常血红蛋白区带，则为α-地贫初筛阳性。

1.3.4 血清铁蛋白检测 采用罗氏E601全自动电化学发光免疫分析仪及配套试剂检测血清铁蛋白。血清铁蛋白正常参考范围：男性 30～400 μg/L，女性 15～150 μg/L。

1.3.5 α-地贫基因诊断

1.3.5.1 DNA样本的提取 取患者抗凝血2 ml，吸200 μl全血于吸有500 μl WB裂解液的试管中振荡均匀，短暂离心后加入100 μl沉淀液PB，振荡均匀后12 000 r/min速度离心5 min，将上清加入离心柱中，分别依次加入已加入无水乙醇的W1一次，W2两次，弃滤液，取出离心柱，于1.5 ml干净离心管，加入100 μl洗脱液EB，离心后，离心管内即为收集备用的DNA溶液。

1.3.5.2 α-地贫3种缺失型诊断 采用跨越断裂点（Gap-PCR）方法诊断中国人常见的α-地贫3种缺失型：东南亚缺失型（--SEA）基因、-α3.7缺失型基因和-α4.2缺失型基因；采用gap-PCR 和反向点杂交芯片技术（RDB），对α-地贫常见的3种非缺失型点突变基因进行检测，包括α2珠蛋白基因突变类型 αWS CD122），CAC-CAG；αQS（CD125），CTG-CCG；αCS（CD142），TAA-CAA。缺失型采用通过电泳来判断结果，突变型采用反向斑点杂交方法，根据显色情况判断结果。

1.4 统计学处理

本文数据资料分析采用SPSS 20.0统计学软件进行处理。计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HbA2正常的静止型和标准型α-地贫中不同基因型所占比例

8 979例疑为地贫血患者中检出为静止型和标准型α-地贫3 588例，阳性率为39.96%。其中HbA2正常2 980例，占83.05%（2 980/3 588），HbA2异 常 608例，占 16.94%（608/3 588），见表 1。

2.2 静止型和标准型α-地贫基因突变与缺失情况

从基因突变的类型看，静止型和标准型α-地中海贫血中无论HbA2是否正常均以缺失型为主，分别为97.71%（3 506/3 588）、93.91%（571/608），两者间比较差异无统计学意义（P>0.05）。在缺失型中东南亚缺失型杂合子（--SEA/αα）2 942例，占比最高为82.00%（2 942/3 588），其次为右缺失型杂合子（-α3.7/αα）394例，占 10.98%（394/3 588），左缺失型杂合子（-α4.2/αα）168例，占4.68%（168/3 588）；而非缺失型只占2.29%（82/3 588），其中ααQS/αα突变22例，占 0.61%（22/3 588），ααCS/αα突 变 45例，占 1.25%（45/3 588），ααWS/αα突变15例，占0.42%（15/3 588），见表1。部分缺失型α-地贫基因检测电泳图谱见图1。

表1 3 588例静止型和标准型α-地贫基因类型在HbA2正常中的占比

图1 部分缺失型α地贫基因检测电泳图谱

2.3 缺铁与HbA2含量的关系

在2 980例静止型和标准型α-地贫HbA2含量正常的患者中，检出1 379例血清铁蛋白降低。检测结果显示，血清铁蛋白<15 μg/L女性铁缺乏患者841例（地贫缺铁组）占60.98%（841/1379），HbA2平均含量为（2.2±0.23）%，对照组530例为（2.4±0.24）%，两者间差异无统计学意义（P>0.05）；血清铁蛋白<30 μg/L男性铁缺乏患者538例（地贫缺铁组）占39.01%（538/1 379），HbA2平均含量为（2.39±0.25）%，而对照组310例含量为（2.5±0.24）%，两者间差异亦无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 血清铁蛋白降低与HbA2含量的关系 [%，（±s）]

表2 血清铁蛋白降低与HbA2含量的关系 [%，（±s）]

性别 组别 HbA2含量 P值女性 地贫缺铁组（n=841） 2.20±0.23 >0.05对照组（n=530） 2.40±0.24男性 地贫缺铁组（n=538） 2.39±0.25 >0.05对照组（n=310） 2.50±0.24

3 讨论

α-地贫在临床上分为4种类型：静止型、标准型、中间型（Hb H病）、重型（Hb Bart’s水肿胎），其分型的机制是根据α-肽链基因缺失或突变的个数来划分。重型Hb Bart’s水肿胎患儿有4个α-肽链基因缺失或突变，常在妊娠晚期中死于宫内中，或出生后几小时内一般都会死亡。中间型Hb H 病患者有3个α-肽链基因缺失或突变，患者为长期轻度或中度贫血，重者可有黄疸，约2/3以上的患者有肝脾肿大，血象出现小细胞低色素改变，红细胞渗透脆性下降及寿命期缩短等症状。静止型和标准型患者α-肽链基因缺失或突变数量较少为1～2个，在临床表现上可无临床症状或仅轻微，但按照孟德尔遗传规律，其孕育的胎儿有可能产生中间型或重型α-地贫儿。目前地贫患者没有有效的药物治疗，主要依靠预防，因此如何加强对静止型和标准型α-地贫的筛查尤为重要。

本研究表明，在采用MCV和MCH两项指标筛查后的可疑地贫患者中静止型和标准型α-地贫阳性率达39.96%，而且其中HbA2正常者占其大部分，为83.05%。从表1结果可以看出，HbA2对静止型和标准型α-地贫的筛查存在较多漏诊，不宜依靠HbA2结果对该类患者进行α-地贫筛查。因此，目前采用MCV、MCH和HbA2这种筛查方式可导致很大部分的静止型和标准型α-地贫漏诊，应引起足够的重视。分析其原因可能与地贫患者易发生多样化的血红蛋白变体有关[6]。虽然常规MCH、MCV检测操作简便且成本低，对地贫患者筛查有一定的可行性，但其灵敏度及特异度不高，容易出现漏诊现象[7-9]。本文研究表明，HbA2在静止型和标准型α-地贫中有很大部分是正常的，这就导致很多地贫患者可能被漏筛，由于HbA2对静止型和标准型α-地贫筛查没有特异性，地中海贫血基因携带者的临床表型又有很高的异质性，而基因诊断是地中海贫血确诊的金标准[10]，才能更好地检出携带者。我们建议应对所有的可疑患者都应进行地中海贫血基因检测，同时无法明确病因或血液学、血红蛋白分析异常，应加强α-地中海贫血的遗传咨询及产前基因诊断具有重要意义。

地贫不仅仅由于珠蛋白基因缺失或突变导致Hb成分改变，幼红细胞利用铁也发生障碍[11]，导致患者血清铁增高[12]，但静止型和标准型α-地中海贫血患者可使血清铁蛋白降低[13]。本研究同时对可能影响HbA2的缺铁因素进行了探讨，结果表明，当女性患者血清铁蛋白<15 μg/L或男性患者血清铁蛋白<30 μg/L时，应该考虑缺铁HbA2含量产生一定的影响，在地贫初筛时应予以考虑。这与相关研究报道相符[14-15]。α-地贫MCV及MCH假阳性主要以小细胞低色素贫血为主，致病原因较多，一般因缺血引起的贫血中有表现为MCH、MCV降低，初筛为地中海贫血患者中也有部分患者属于缺铁性贫血所致，因此，初筛为地贫的患者需经过血清铁蛋白检测排除，降低地中海贫血假阳性发生，减少对地中海贫血和珠蛋白生成障碍性贫血并发缺铁性贫血（IDA）的误诊[16]。受检者HbA2虽然处于正常范围，但由于MCV或MCH异常，同样有必要进行基因检测，以免漏诊。

综上所述，HbA2在静止型和标准型α-地中海贫血患者筛查中，具有一定的价值，但易导致漏诊发生和缺铁的干扰。因此，HbA2作为地中海贫血的有力筛查手段，应配合血细胞指标CMV、MCH和基因诊断才能更好地为临床确诊提供靠依据。