一株高效溶磷且抑真菌的水生拉恩氏菌MEM40筛选鉴定及其水稻促生研究

孙孝文，马卫，王慧敏

（1.江汉大学 持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，湖北 武汉 430056；2.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062）

现代农业生产中，化肥的大面积使用，在提高农产品的产量的同时也产生了严重的生态环境问题[1]。过量使用化肥容易导致土壤酸化与土壤板结，加剧环境水体的污染，土壤菌群多样性改变，最终导致小麦等农产品产量和质量下降，甚至可以威胁到人类的健康等问题[2]。因此，科学施用化肥，提高肥料利用率，减少化肥施用，有效降低化学肥料对环境的危害，实现农业与环境的可持续发展，具有重要的意义[3]。

现如今，植物-微生物协作提高作物产量，从而替代化肥或者减少化肥的使用是当前农业研究领域的热点之一[3，4]。其中，植物促生根际细菌能够定殖于植物根部、根际土壤以及根的表面，且能够直接或间接促生植物生长，包含溶磷菌、固氮菌、产生长素（IAA）的细菌、以及产铁载体的细菌等[4]。水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）是一种兼性厌氧，无色素的杆状细菌，属于肠杆菌科，已经在各种环境中被发现，包括淡水，土壤，植物根际，和冷藏食品[5]植物-微生物相互作用的研究表明，水生拉恩氏菌的一些成员具有溶磷、产IAA和固氮等能力，可作为植物根际促生细菌为植物的生长发育提供营养[6]。此外，它们还可作为生物防控制剂，用于防治一些植物病害，包括葡萄藤冠瘿病、苹果火灾枯萎病和水果贮藏腐烂[7]。

本文从湖北钟祥稻麦轮作区水稻根际土壤中筛选到一株植物促生根际细菌水生拉恩氏菌MEM40。该菌株对磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉均具有明显的解磷效果，可对水稻具有明显的促生作用。此外，还发现该菌株可以明显抑制水稻稻瘟病和小麦赤霉病的病原菌（Magnaporthe oryzae[8]和Fusarium graminearum[9]）。因此，水生拉恩氏菌MEM40是一株高效溶磷且抑真菌的植物促生根际细菌，对植物病原真菌防治，提高肥效减少化肥施用具有应用潜力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土样采集于湖北省钟祥市磷矿镇稻麦轮作区水稻根际土壤。磷酸钙、磷酸镁以及其他常用试剂采购于国药化学集团化学试剂有限公司。磷矿粉和市售肥料采购于湖北鄂中生态股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水稻根际土壤溶磷细菌MEM40的筛选

取水稻根际土壤10.0g，添加至90.0ml磷酸钙培养基中，30℃、150rpm条件下，震荡富集培养2天。将富集后的培养液采用梯度稀释涂布法涂布于磷酸钙固体培养基平板上，与30℃继续培养7天。选取具有明显溶磷圈的菌落，经过多次反复划线纯化，得到溶磷细菌MEM40。

1.2.2 水稻根际土壤溶磷细菌MEM40的鉴定

将溶磷细菌MEM40单菌落挑取至LB培养基于30℃、150rpm条件下过夜活化。在LB平板上划线，28℃倒置培养2天后，观察细菌菌落形态。16SrDNA鉴定方法参考陈玲等方法进行。

1.2.3 水稻根际土壤细菌MEM40溶磷效果测定

将溶磷细菌MEM40单菌落挑取至LB培养基于30℃、150rpm条件下过夜活化。以2.0%的接种量分别接种到磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉培养基中，于30℃、150rpm条件下震荡培养。24h后取4ml样品，8000rpm离心10min，采用国标GB11893-89-钼酸铵分光光度法测定上清液中可溶性磷含量。使用pH计测定上清液中pH。不加菌液的培养基作为空白对照。每个样品重复三次。

2 结果与分析

2.1 水稻根际土壤细菌MEM40的筛选和鉴定

通过梯度稀释涂布法从稻麦轮作区水稻根际土壤中筛选到MEM40菌株。菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉），保藏号为CCTCCNo.M2018463，全基因组[7]数据已公布于NCBI，登录号GCA_004328445.1。如图1A所示，MEM40菌株能在磷酸钙固体培养基上形成明显的水解圈，表明MEM40菌株为一株溶磷菌。将MEM40菌株在LB固体培养基上28℃培养2天后，如图1B所示，MEM40菌落为不透明乳白色，隆起，边缘齐整。

M E M 4 0 菌株1 6 S r D N A 进行多序列比对后，使用MEGA6.0软件对序列相似度较高的相关典型菌株进行聚类分析构建了系统进化树。结果如图2所示，MEM40菌株16SrDNA与Rahnella aquatilis CIP 78.65T（CP003244）的16SrDNA序列相似性最高，达到了99.65%。结合细胞形态、生理生化数据和16SrDNA多序列比对分析，将MEM40菌株归属为Rahnella aquatilis。

2.2 水稻根际土壤细菌MEM40的溶磷活性

MEM40菌株分别在含有三种难溶性磷酸盐（磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉）的液体培养基中，以2.0%接种量，28℃、180rpm振荡培养24h后，分别测定了液体培养基中可溶性磷酸盐含量和pH。如图3所示，MEM40菌株对磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉均表现出良好的溶解能力。MEM40菌株对磷酸镁溶磷能力最高，其液体培养基中可溶性磷酸盐含量为380.98±4.01mg/L，pH由初始7.0下降至3.51±0.39。MEM40菌株对磷酸钙溶磷能力次之，其液体培养基中可溶性磷酸盐含量为289.41±15.44mg/L，pH由初始7.0下降至4.26±0.17。MEM40菌株对磷矿粉溶磷能力最低，其液体培养基中可溶性磷酸盐含量为155.00±6.78mg/L，pH由初始7.0下降至5.99±0.32。

2.3 水稻根际土壤细菌MEM40的抑真菌活性

水稻稻瘟病菌和禾谷镰刀菌分别是水稻稻瘟病和小麦赤霉病的主要病原真菌。如图4所示，MEM40菌株在PDA平板上可以明显抑制稻瘟病菌和禾谷镰刀菌菌丝体的生长。说明MEM40菌株在水稻稻瘟病和小麦赤霉病的防治方面有潜在应用价值。

2.4 水稻根际土壤细菌MEM40对水稻的促生盆栽实验

水稻促生盆栽实验种植80天后，将水稻完整挖出，使用清水洗净泥土并阴干后，测定了水稻的分蘖数、株高、鲜重和干重。如表2所示，施加MEM40菌剂实验组与对仅施加市售肥料的对照组相比，水稻分蘖数增加了11.21%，株高显著性增加了11.36%，干重显著性增加了29.11%。施加MEM40菌剂的水稻长势明显优于仅施加市售肥料的对照组。因此，施加MEM40菌剂对水稻生长具有促进作用。

表1 施用MEM40菌株对水稻生长的影响

3 结语

本研究在水稻根际土壤中筛选到一株植物根际促生细菌水生拉恩氏菌MEM40。MEM40菌株具有高溶磷活性，可促进水稻生长，具有提高肥料利用率和减少化肥使用量，防止土壤酸化与土壤板结具有一定的的应用潜力。此外，MEM40菌株还具有抑制稻瘟病菌和禾谷镰刀菌的活性，将有利于植物病原真菌防治，减少农药使用，增加农产品品质。然而，如何实现工业制备MEM40菌剂，以及水稻大田促生实验还需要进一步研究。