RNA 干扰技术及其在医疗领域的应用

王宣傲

（北京市顺义牛栏山第一中学，北京 101301）

0.引言

20 世纪80 年代，“基因功能及其调控”逐渐成为基因研究的重点。一系列研究结果表明，物种的复杂性与基因组中编码基因的数量之间没有相关性：果蝇的编码基因数量比圆虫少很多，而水稻植物的基因比人类多。研究人员发现，基因表达调控与物种的复杂性有一定的关系。基因表达调控不仅与转录、翻译这些生理过程相关，而且与表观遗传调控有一定的关系。不过，当时的科学家尚不清楚基因表达调控的具体机制。

在研究植物的过程中，科学家发现，一些分子量较小的RNA 可以有效地抑制基因的表达，他们将这种现象命名为“有义共抑制”（也被称为转录或转录后基因沉默）。更深入的研究表明，与RNA 合成和降解相关的酶与基因沉默息息相关。RNA 依赖RNA 聚合酶（RdRp）可以将有义转录本作为模板，产生双链RNA（dsRNA），并触发RNA 沉默。向细胞中注射反向重复DNA 序列或通过其他方式提高细胞中dsRNA 分子的水平，也会抑制相关基因的表达。这一发现是十分惊人的，因为当时的科学家几乎从未考虑过，可以通过改变细胞质中特定RNA 的水平调节基因的表达。许多国家的研究人员对这一现象进行了深入的研究，他们发现，在原生生物、丝状真菌、无脊椎动物以及脊椎动物中，都存在类似的现象。由于这些具有双链结构的RNA 可以干扰基因的表达，科学家将其称为小干扰RNA（siRNA），将这种干扰现象称为RNA 干扰。

几十年来，RNA 干扰领域不断取得重大进展，科学家设计了许多种含有不同碱基的siRNA，从而提高其在不同环境条件下的稳定性，提高干扰效率。RNA 干扰技术在农业、科研、医疗等领域有着十分广泛的应用。一些从事生物医学研究的科学家发现，向人体中注入特定的siRNA，可能有助于抑制某些基因的表达，使患者更快地恢复健康。许多研究人员发现，与反义寡核苷酸相比，siRNA 对核酸酶更具抵抗力，并且治疗效果更好。将siRNA 高效地递送到各种细胞系和原代细胞中后，它们可以高效地发挥作用。将siRNA 注入人体后，siRNA 可以使几乎任何与疾病相关的靶基因沉默，这为遗传病和自身免疫病等基因相关疾病的治疗提供了新思路。深入分析RNA 干扰技术的研究进展及其在医疗领域的应用，有助于人们更高效地治疗一些棘手的慢性遗传病、慢性传染病等。

1.RNA 干扰的研究历史

20 世纪80、90 年代，一些科学家在研究基因的过程中，开展了多项与DNA 和RNA 相关的实验。一些科学家在研究RNA 的性质的过程中，发现了RNA 干扰现象（RNAi）。研究人员在使用体外合成的RNA 进行反义研究时，发现了与经典的反义抑制理论相矛盾的结果：注射了正义RNA 和反义RNA 的细胞具有相似的表型。Craig Mello 及其同事也在实验中发现了类似的现象，他们将这种现象命名为“RNA 干扰”（RNAi），以区别于经典的反义抑制。此外，Mello 还注意到这些短链RNA 可以扩散到注射部位附近的其他组织，这表明干扰RNA 可以跨越细胞界限，在不同组织间长距离传递和维持。不过，当时的科学家无法确定这种现象是由哪种RNA 引起的[1]。

在20 世纪90 年代初，华盛顿卡内基研究所胚胎学系的安德鲁·费尔（Andrew Fire）发现双链RNA（dsRNA）可以高效地降解秀丽隐杆线虫中的特定mRNA，而反义RNA则没有这种功能。Fire 认为，由于体外合成反应中使用的病毒RNA 聚合酶可以催化多种反应，应用质粒模板进行体外转录反应时，体系中可能不仅含有正义RNA 和反义RNA，也含有dsRNA。也就是说，制得的RNA 产物可能是被dsRNA 污染的。Fire 用单链RNA（ssRNA）和dsRNA 的纯化制备物检验了这一假设。用凝胶纯化ssRNA 后，注射这些ssRNA 并不能使动物产生相应的表型。他们将正义链和反义链在体外退火，得到了一些dsRNA，将这些dsRNA 注入动物后，动物体内的一些mRNA 会相对较快地降解，且这种降解具有较高的特异性。这些研究人员还发现，降解最快的mRNA 序列与dsRNA 的正义链十分相似[2]。

这些研究表明，dsRNA 可能与mRNA 降解和基因表达调控密切相关，后来，一些科学家对这一现象进行了更加深入的研究。他们发现， dsRNA 分子可以以同源依赖的方式降解靶标mRNA。较长的dsRNA 可被Dicer 酶（一种dsRNA 特异性核酸内切酶）切割，产生长度为21 ～23bp的小干扰RNA（siRNA）。Dicer-siRNA 可以与TAR RNA结合蛋白（TRBP）发生相互作用，并形成RNA 诱导的沉默复合体（RISC），降低特定基因的表达水平。此外，RISC还可以与argonaute 2（Ago2）发生相互作用，后者是一种效应核酸酶，它也可以在5'端切割靶mRNA，使靶mRNA降解为较短的片段，无法翻译为蛋白质。这些研究结果表明，具有特定序列的双链RNA 可以高效地降解mRNA，干扰基因的表达。后来，生物科学研究者将这类现象统一称作RNA 干扰[3]。

2. RNA 干扰技术的研究进展

2.1 siRNA 合成

目前，我们通常用化学方法合成siRNA，或者从培养的细胞中提取siRNA。然而，这些siRNA 的干扰效率，有时并不理想。如何改进siRNA 合成技术，是一个十分重要的问题。一些研究人员连接了解旋酶结合组成性转运元件（CTE）基序和Bcl2 的反义寡核苷酸，并将其导入细胞内，他们发现，与解旋酶偶联的杂合寡核苷酸的干扰效果更好，杂合寡核苷酸可以更高效地募集细胞解旋酶，并改善寡核苷酸与目标序列的结合情况。

2.2 基于载体的siRNA 表达

用化学方法合成的siRNA 的成本很高，且所合成的siRNA 活性较低。我们可以利用各种启动子表达盒，将细胞变成siRNA 合成工厂。一些研究人员成功地利用哺乳动物细胞合成siRNA，降低了siRNA 的生产成本。

此外，利用载体生产的siRNA 活性较高，能够稳定地抑制靶基因的表达。因此，利用这些siRNA，我们可以完成实验周期较长的基因功能分析。

研究人员常常利用Pol III 启动子（例如U6 snRNA，H1和tRNA）表达siRNA。首先，在天然状态下，细胞利用Pol III 启动子转录相对较小的RNA，例如tRNA 和snRNA。其次，Pol III 启动子在G 或A 处开始转录。利用Pol III，我们可以预先确定siRNA 的起始位点，也可以随时将需要的序列插入转录起始位点的下游，从而得到目的产物。此外，利用Pol III，我们可以高效地控制RNA 的聚合过程，只需要向培养基中加入四环素或Cre-loxP，就可以改变细胞中siRNA 的表达水平。因此，我们通常利用这种启动子，研究瞬时表达基因或致死基因的功能[4]。

目前，可以通过两种方法，在体内表达特定的siRNA。第一种方法是，采用Pol III 启动子，指导小的反向重复序列的合成，这些重复序列由可变长度的间隔区隔开，合成的RNA 包含特定的靶序列、环序列（3 ～9nu）和30U 突出端的茎，这些RNA 会在酶的辅助下形成发夹结构。体内的Dicer 酶会进一步加工这些短发夹RNA（shRNA），使其发挥作用。第二种方法是，将两个U6 启动子串联在同一个载体中，或放在两个单独的载体中，从而指导靶向序列和含30-UUUU 突出端的小RNA 的转录。有义链和反义链将在体内形成双链体，其功能类似于体外的siRNA。大多数研究表明，这两种方法都可以产生高活性的siRNA，高效抑制靶基因的表达。不过，在低浓度下，发夹型siRNA表达载体的抑制活性明显高于串联型siRNA 表达载体。此外，科学家尝试对发夹型靶序列进行修饰，这些修饰不影响其活性，但可以提高其在细菌内的稳定性。我们还可以通过其他方法，优化载体结构，从而改变所合成的siRNA的活性。科学家发现，由tRNA（Val）或U6 启动子驱动的siRNA 的活性存在一定的差异，tRNA-siRNA 的转录本比U6-siRNA 更稳定，而且tRNA-siRNA 在Dicer 酶的作用下可以产生更多的siRNA[5]。

一些科学家利用CMV 启动子，成功地在培养的细胞中合成了有效的siRNA[6]。为了构建该基于Pol II 启动子的系统，他们将发夹序列引入CMV 启动子的转录起始位点，并使用特定的终止子序列，及时终止转录。除Pol III 启动子外，我们还可以应用其他启动子（如Pol II 启动子）合成siRNA。大量研究表明，Pol II（CMV）和Pol III（tRNAVal）特异性启动子可以成功地抑制哺乳动物细胞中的萤光素酶报告基因。一些科学家开发了载体pDECAP，从而提高siRNA 的表达效率。这种载体可以高效地表达来自RNA 聚合酶II（Pol II）启动子的长双链RNA（dsRNA）。pDECAP的转录本既没有50 帽结构，也没有30-poly（A）尾部，转录出的dsRNA 可以快速到达细胞质[7]。因此，这种载体可以高效地降低特定基因的表达水平，为研究细胞、组织及整个动物系统中的基因功能提供了新思路。

3. RNA 干扰技术在医疗领域的应用

3.1 治疗疾病

应用RNA 干扰技术，医疗工作者可以高效地治疗病毒性疾病和肿瘤。虽然目前多数研究仅在哺乳动物细胞系和动物模型中进行，但可以预见的是，随着RNA 干扰技术的逐步成熟，其必将成为人类战胜难治性遗传病、感染性疾病的有力武器。

研究表明，RNA 干扰技术可以在体内有效抑制人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鼠丙种疱疹病毒和人免疫缺陷病毒的复制。不过，一些病毒可能会迅速地变异，导致导入的siRNA 不能有效地与其结合。

RNA 干扰技术也在肿瘤的治疗过程中发挥着重要的作用。许多国家的肿瘤生物学实验室和生物制药公司致力于研究siRNA 的功能，并将其作为整体药物开发策略的一部分。一些研究人员发现，靶向结肠肿瘤细胞系survivin 基因的siRNA 可以抑制肿瘤的生长。这一发现是十分令人兴奋的。它可能为治疗结肠癌提供新思路。与目前的基因疗法临床试验相似，在siRNA 治疗技术到达临床试验阶段后，科学家需要采取所有适当的保护患者的措施（如独立审查、自愿知情同意等），保障患者在接受siRNA 治疗过程中的权利。不可置疑的是，前沿的病毒载体传递方法是较为有效的，但是如何提高其安全性，避免这些siRNA在进入人体后产生不良反应，是一个颇具挑战性的问题。

3.2 预防疾病

肉类安全问题一直是人们重点关注的问题。研究表明，牲畜疾病严重地威胁着肉类的安全。如何更有效地预防动物患病，控制传染性疾病的传播，是农牧业科研人员面临的重大挑战。RNAi 技术在疾病的预防中发挥着重要的作用。在研究预防口蹄疫（FMD）的策略以及控制流感病毒H1N1 的方法时，研究人员都需要应用RNA 干扰技术，研究某一干预方法对疾病传播和动物健康状况的影响。2014年，一些研究人员通过向受精卵中注射siRNA，成功地获得了对PRRSV 特异性表达的转基因(TG)猪，经过TG 猪与NTG 对照发现，体内siRNA 表达使猪血清HP-PRRSV 含量显着降低 ，并且增加3d 的存活时间，RNAi 技术为家畜抵抗病毒感染提供可能性。

4.结语

RNA 干扰技术是一项十分重要的诱导基因沉默的技术。深入研究其作用机理，实现特定时间内的基因表达调控和组织特异性表达，是未来的主要研究方向。此外，科学家还需对siRNA 在人体中的代谢过程进行深入的研究，从而减轻siRNA 治疗的副作用，使其在医学领域的应用更广泛。