低温处理对茶树叶片中γ-氨基丁酸和其他活性成分含量的影响

夏兴莉，廖界仁，任太钰，马媛春，王玉花，房婉萍，朱旭君

(南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)

γ-氨基丁酸(GABA)是一种有天然活性的非蛋白质氨基酸，广泛分布于动物和植物体内，有多种生理功能[1-2]。富含GABA的茶树〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕叶片有降血压和减少细胞凋亡等生物活性[3-5]，因而，提高茶叶中GABA含量可提升茶叶的保健功效。目前，茶叶GABA的富集主要采用厌氧处理，邢志强[6]采用多种胁迫方法研究了茶叶中GABA的富集效应，认为水浸渍、真空、紫外线和冷冻处理富集GABA的效果均低于各类厌氧处理；然而，虽然厌氧处理富集GABA效果较好，但会导致茶叶的色泽与性质发生变化，对茶叶品质有较大影响[7-8]，因而，探究既能富集茶叶中GABA又对茶叶品质影响较小的处理技术十分必要。

目前，低温处理富集GABA在桑(MorusalbaLinn.)[2]和马铃薯(SolanumtuberosumLinn.)[9]等植物中已得到验证。低温处理在茶叶运输和贮藏等环节有重要作用，可延缓茶叶品质劣变。为明确低温处理对茶叶中GABA富集的影响，探讨GABA含量与茶叶品质的关系，作者以茶树品种‘龙井43’(Camelliasinensis‘Longjing 43’)为研究对象，测定4 ℃低温处理不同时间后茶树叶片中GABA和其他活性成分含量的变化，以期为茶叶中GABA含量富集技术及品质调控奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试茶树品种‘龙井43’于2018年4月28日采自南京中山陵园管理局中山陵茶厂试验茶园(东沟一区地)，采摘标准为一芽一叶至一芽二叶，共采集叶片约200 g。将鲜叶置于4 ℃下分别处理0(对照)、3、6和9 h，微波(75 W)杀青、揉捻后，于80 ℃烘干至恒质量，冷却后磨成粉，待用。

主要仪器：UH5300双光束分光光度计(日本Hitachi公司)、L-8900氨基酸全自动分析仪(日立高新技术公司)、Agilent Infinity 1290超高压液相色谱仪(美国Agilent公司)。标准品：GABA(纯度大于等于99.90%)、咖啡碱(纯度99.90%)以及儿茶素类(包括没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，纯度99.99%)标准品均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GABA标准品测定和标准曲线绘制 用超纯水将1 mg·mL-1GABA标准品母液逐级稀释至0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μg·mL-1。各取200 μL样品，加入100 μL OPA衍生试剂〔0.05 mol·L-1硼酸缓冲液(pH 9.5)50 mL和0.2 mol·L-1NaOH溶液23 mL的混合溶液〕反应1 min，加入0.1 mol·L-1KH2PO4溶液200 μL，即为对照品溶液。按照下述色谱条件对标准品溶液进行测定。

色谱条件： ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相A为20 mmol·L-1乙酸，流动相B为V(20 mmol·L-1乙酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2的混合液，0～4 min体积分数65%流动相A，4～8 min体积分数60%流动相A，8～13 min体积分数50%流动相A，再运行3 min；流速0.3 mL·min-1；柱温40 ℃，激发光350 nm、发射光450 nm；进样量2 μL。以峰面积为纵坐标、GABA标准品溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，拟合方程为y=331.113x-18.078(R2=0.998)，线性范围0.005～2.500 μg·mL-1。

1.2.2 样品中GABA提取和测定 称取0.5 g样品粉末，加入25 mL蒸馏水，于85 ℃水浴提取2 h；取5 mL提取液，室温下12 000 r·min-1离心10 min；取上清液3 mL，加入600 μL三氯甲烷，室温下12 000 r·min-1离心10 min；取上清液800 μL，用0.2 μm聚四氟乙烯滤膜过滤，得到样品溶液。按上述GABA标准品的测定方法和色谱条件测定样品溶液中的GABA含量。按照峰面积归一化法计算样品中GABA含量。

1.2.3 样品中其他成分含量测定 根据GB/T 8305—2013中的方法测定水浸出物含量，根据GB/T 8314—2013中的方法测定游离氨基酸含量，根据GB/T 8313—2018中的方法测定咖啡碱、茶多酚和儿茶素类含量。

2 结果和分析

在4 ℃低温处理0(对照)、3、6和9 h后，茶树叶片中GABA含量的变化见图1，茶树叶片中水浸出物、游离氨基酸、咖啡碱、茶多酚和儿茶素类含量变化见表1。

不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

表1 4 ℃低温处理不同时间对茶树品种‘龙井43’叶片中主要活性成分含量的影响

由图1可见：随低温处理时间的延长，茶树叶片中的GABA含量呈先升高后降低的变化趋势，并在处理6 h后达到最高(0.98 mg·g-1)，在处理9 h后降至最低(0.80 mg·g-1)，且二者与对照(处理0 h)和其他处理时间均存在显著(P<0.05)差异。

由表1可见：经4 ℃低温处理不同时间后，茶树叶片中的水浸出物、游离氨基酸、茶多酚和儿茶素类含量存在一定差异，而咖啡碱含量无显著差异。其中，处理3～9 h后水浸出物和游离氨基酸的含量均显著高于对照，处理9 h后茶多酚和儿茶素类含量均显著低于对照，但其他处理时间均与对照无显著差异。

由表1还可见：经4 ℃低温处理不同时间后，没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素含量均无显著变化，而表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素没食子酸酯含量在处理9 h后显著低于对照，但其他处理时间均与对照无显著差异。

总体上看，4 ℃低温处理3和6 h后茶树叶片中的水浸出物和游离氨基酸含量显著高于对照，咖啡碱、茶多酚和儿茶素类含量与对照无显著差异。

3 讨论和结论

已有研究结果表明：在低温环境下菠菜(SpinaciaoleraceaLinn.)[10]、胡萝卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)[11]和荔枝(LitchichinensisSonn.)[12]叶中的GABA含量均不同程度升高；而本研究中，4 ℃低温处理6 h后，茶树叶片中GABA含量显著(P<0.05)高于对照(处理0 h)，说明低温处理可富集茶树叶片中GABA。这是由于低温处理可加速蛋白质分解，活化GABA合成酶谷氨酸脱羧酶(GAD)催化谷氨酸合成GABA，同时在低温条件下GABA代谢酶(GABA-T)的活性降低，阻碍了GABA代谢，使GABA得到富集[7，13]。

尽管厌氧处理具有明显的GABA富集效应，但长时间厌氧处理易造成茶叶品质和口感变化[1，7-8]。经4 ℃低温处理3和6 h后，茶树叶片中的水浸出物和游离氨基酸含量显著增加，而咖啡碱含量、茶多酚和儿茶素类含量无显著变化，其中酯型儿茶素类成分(苦涩味成分)含量一定程度降低，表明4 ℃低温处理3～6 h既可保持茶叶品质，又能富集GABA。

由于本实验设计较为粗放，涉及的茶叶品种单一，因而，后续将细化低温处理条件(包括处理温度和处理时间)，扩大茶树品种范围，针对不同茶树品种筛选出各自适宜的低温处理条件，以期为茶叶中GABA富集技术的开发应用提供基础研究数据。