一步法合成聚乙烯亚胺保护的荧光银纳米簇用于甲硝唑检测

2020-12-06 10:41刘梦旋尹建行孟磊徐娜
分析化学 2020年11期
关键词:甲硝唑

刘梦旋 尹建行 孟磊 徐娜

摘 要 甲硝唑(MNZ)是普遍使用的一种硝基咪唑类抗生素,多用于治疗厌氧菌引起的感染或动物饲料的添加剂,残留过量时会产生致畸、致癌等作用,因此准确检测MNZ十分必要。本研究利用微波技术,采用一步法成功合成了聚乙烯亚胺保护的银纳米簇(AgNCs@PEI)荧光探针,所合成的AgNCs在高离子强度及长时间光照下具有良好的荧光稳定性。AgNCs配体中的大量氨基官能团与MNZ中咪唑环内N原子之间的氢键作用,使二者形成稳定的非辐射基态配合物,导致AgNCs荧光强度下降,基于此建立了检测MNZ的荧光分析方法。线性范围为0.1~200 μmol/L,检出限为0.038 μmol/L(S/N=3),方法具有良好的选择性。将此荧光探针应用于人尿液中MNZ的测定,回收率为95.8%~103.4%,相对标准偏差小于4.3%。

关键词 聚乙烯亚胺; 银纳米簇; 甲硝唑; 荧光探针

1 引 言

甲硝唑(MNZ)是硝基咪唑类抗生素中的一种,主要用于临床治疗和预防厌氧菌引起的感染疾病 [1~3]; 同时还具有促进牛、猪及家禽生长和提高饲料喂养效率的作用,也是一种常用的动物饲料添加剂。当MNZ的累积剂量或残留量超过一定数值时,则具有潜在的致畸、致癌、致突变作用和遗传毒性 [4~6]。 因此开发高选择性、高灵敏检测MNZ的方法十分必要。

目前,检测MNZ主要方法有高效液相色谱法[7,8]、高效液相色谱-质谱法[9]、 电化学分析法[10,11]和气相色谱法[12,13]等,但这些方法大多存在灵敏度低、过程繁琐、成本高等缺点。相比于传统的检测方法,基于荧光探针的分析方法具有灵敏度高、快速、廉价、简单以及实用性强等特点。银纳米簇(AgNCs)作为一种新型的荧光纳米材料,因其具有量子产率高、发射波长可调、生物相容性好等优点,被广泛用于生物成像、分析检测、催化等领域[14~16]。合成AgNCs的传统方法有水热法[17]、化学刻蚀法[18]等,但这些方法仍存在AgNCs粒径均匀性较差、稳定性不佳、制备过程复杂等问题。微波合成法利用其介电热效应将电磁能转化为热能,与传统合成方法相比,该方法所制备的纳米材料具有尺寸均一、物理化学性质稳定、制备过程易于控制且合成时间较短等特点[19,20]。

本研究采用一步微波法合成了一种基于聚乙烯亚胺保护的银纳米簇(AgNCs@PEI),合成方法简单、快速、成本低。制备的AgNCs@PEI稳定性良好,可作为荧光探针对痕量MNZ进行检测,方法灵敏度高、选择性好。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

T20型透射电子显微镜 (美国FEI公司);  LS-55荧光分光光度计(英国PE公司);  UV-2200双单色器双光束紫外可见分光光度计 (北京瑞利分析仪器公司); FE20型pH计 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司);  MAS-II Plus常压微波合成/萃取反应工作站(上海新仪微波化学科技有限公司);

聚乙烯亚胺(PEI,MW 10000)、 MNZ、谷胱甘肽(GSH)(上海阿拉丁试剂公司);  AgNO3(国药集团化学试剂有限公司); 抗坏血酸(AA)、牛血清蛋白(BSA)以及20种天然氨基酸(Val、Met、Cys、Ile、Pro、Arg、Phe、Gly、Gln、Glu、Thr、Trp、Ser、Ala、Asp、Lys、Leu、Asn、Tyr、His)(南京奥多福尼生物科技有限公司)。所用试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水。

所用缓冲溶液为Briton-Robinson(BR)缓冲溶液,由一定比例的0.04 mol/L的磷酸、硼酸、醋酸混合而成,用NaOH溶液调节pH值分别为3~11。

2.2 实验方法

2.2.1 AgNCs@PEI的合成 参考文献[21]的方法并稍作改进。将3.75 μmol/L PEI溶于15 mL超纯水,加入3.75 μmol/L AgNO3,搅拌2 h后,用1.0 mol/L的HCl或NaOH调节混合体系的pH值为3~11; 最后加入AA,将混合溶液置于微波合成仪中,在60℃、100 W条件下反应一段时间,所得反应液用0. 22 μm 滤膜过滤,于4℃保存,备用。

2.2.2 MNZ的检测 800 μL不同浓度的MNZ 溶液分别与200 μL AgNCs@PEI、1000 μL BR缓冲液(pH 6)混合,静置 2 min,测定反应体系的荧光光谱,激发波长455 nm。

2.2.3 选择性测试 配制 10 mmol/L Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl、CO23、HCO3、HPO24、H2PO4、PO34、葡萄糖与20种天然氨基酸(Val,Met,Cys,Ile,Pro,Arg,Phe,Gly,Gln,Glu,Thr,Trp,Ser,Ala,Asp,Lys,Leu,Asn,Tyr,His)溶液。取800 μL不同物质溶液和200 μL AgNCs@PEI、1000 μL BR缓冲液(pH 6)混合,静置2 min,测定荧光光谱,激发波长455 nm。

2.2.4 实际样品分析 尿液来源于健康志愿者。在200 μL尿液中添加800 μL不同浓度的MNZ,与200 μL AgNCs@PEI原液、800 μL BR缓冲液(pH 6)混合,静置孵育2 min,测定荧光光谱,激发波长455 nm。

3 结果与讨论

3.1 AgNCs@PEI的表征

图1A为AgNCs@PEI的透射电镜图,可以看出纳米颗粒的分散性高且粒径均一,平均粒径约为2.6 nm,其晶面间距为0.236 nm(图1B),为Ag(111)晶面[22],表明成功合成了AgNCs@PEI。在AgNCs@PEI的吸收光谱中,在350 nm附近存在一个较宽的吸收峰(图1C),但没有表面等离子体共振(SPR)吸收带,表明不存在大的Ag纳米颗粒。图1D为AgNCs@PEI的荧光激发与发射光谱,最大激发波长为455 nm,最大发射波长为545 nm,说明AgNCs@PEI具有较大的斯托克斯位移(~90 nm)。如图1E所示,AgNCs@PEI的XPS谱图中Ag的特征峰表明,AgNCs主要由Ag0和Ag+組成,簇表面Ag+的存在,有利于电子由PEI向AgNCs转移,从而产生荧光[23]。

3.2 AgNCs@PEI合成条件优化

3.2.1 合成反应时间对荧光强度的影响 保持其它实验条件不变,在不同合成反应时间下制备AgNCs@PEI,测定其荧光光谱。实验结果表明,反应时间为15 min时,所制备的AgNCs@PEI荧光强度最高(图2A)。相比于文献[21]中采用的溶液搅拌方法(~48 h), 合成时间大幅缩短,说明微波方法可以有效提高合成效率。

3.2.2 pH值对荧光强度的影响

用1 mol/L的HCl或NaOH分别将PEI和AgNO3混合溶液的pH值调至3、5、7、9和11,然后向其中加入37.5 μmol/L AA,在微波合成仪中反应15 min,得到不同的AgNCs@PEI。由图2B可知,合成溶液的pH =5时,得到的AgNCs@PEI的荧光强度最高。

3.2.3 Ag+与AA的摩尔比对荧光强度的影响 保持其它实验条件不变,在Ag+与AA的摩尔比分别为1∶1、1∶5、1∶10和1∶15时,采用微波合成仪合成不同的 AgNCs@PEI。结果显示(图2C),当Ag+与AA的摩尔比为1∶10时(3.75 μmol/L AgNO3,37.5 μmol/L AA),AgNCs@PEI的荧光强度最高。此结果与文献[21]一致。

3.3 AgNCs@PEI的稳定性

在高离子强度下, 考察了AgNCs@PEI的稳定性和抗光漂白性能。图3A为AgNCs@PEI在 545 nm处荧光强度随NaCl浓度变化的柱状图,可见AgNCs@PEI荧光强度随NaCl浓度的变化较小,说明AgNCs@PEI在高浓度离子溶液中具有较好的荧光稳定性。由图3B可知,AgNCs@PEI经455 nm (光强度 750 a.u.)光照30 min后, 其荧光强度基本保持稳定,表明合成的AgNCs@PEI具有良好的光稳定性。在不同pH值下,AgNCs@PEI在545 nm的荧光强度如图3C所示,在酸性和中性条件下的荧光强度较高。

3.4 AgNCs@PEI对MNZ的检测

3.4.1 可行性测试及检测条件的优化 在制备的AgNCs@PEI中分别加入200和500 μmol/L MNZ,荧光光谱如图4A所示。结果表明,MNZ能够淬灭AgNCs@PEI的荧光,且随着MNZ浓度增加,AgNCs@PEI荧光猝灭程度增大。图4B为AgNCs@PEI对MNZ(500 μmol/L)的荧光响应时间,可见荧光强度随时间的延长而下降,在1 min后趋于稳定。为了得到稳定的荧光响应信号,后续实验均在孵育 2 min后进行测试。此外,考察了检测体系的pH值对荧光响应的影响,分析了不同pH值下MNZ对AgNCs@PEI荧光的猝灭效果。如图4C所示,在体系中加入500 μmol/L MNZ,AgNCs@PEI的荧光强度在pH=6时荧光猝灭程度最高,因此选择检测MNZ体系的pH=6。

3.4.2 AgNCs@PEI对MNZ的分析性能 不同浓度MNZ存在时, AgNCs@PEI的荧光光谱图如图5A所示。随着MNZ浓度增加,AgNCs@PEI在545 nm处的荧光强度随之下降,在1500 μmol/L时基本完全猝灭。在545 nm处的相对荧光强度(F0-F,F0和F分别表示加入MNZ前后的探针荧光强度)与MNZ浓度在两段浓度范围内均呈良好的线性关系(图5B)。在15~200 μmol/L范围内,线性方程为F0-F=1.2644CMNZ +66.5298(R2=0.9946); 在 0.1~15 μmol/L范围内,线性方程为F0-F=4.3308CMNZ+13.7640(R2=0.9916),检出限(S/N=3)為0.038 μmol/L。与文献报道的检测MNZ的纳米荧光探针相比,本方法的检出限及线性范围与其它方法相当或者更优(表1)。

3.4.3 AgNCs@PEI对MNZ荧光响应的选择性分析 考察了AgNCs@PEI对不同离子及氨基酸的抗干扰性能。在分别含有500 mmol/L MNZ和其它分析物的检测体系中,只有MNZ能够明显猝灭AgNCs@PEI的荧光,而其它分析物对AgNCs@PEI荧光响应变化值<6.5%(图6),说明基于AgNCs@PEI探针检测MNZ具有良好的选择性。

3.4.4 检测机理研究 具有较大斯托克斯位移的荧光纳米簇,其荧光的产生主要来源于以金属为中心的三线激发态辐射弛豫,而非金属簇内核量子化束缚所引起的[29]。这种弛豫过程与纳米簇的保护配体有关,例如配体分子内的振动和转动常导致三线激发态非辐射弛豫的发生。因此,研究加入MNZ前后AgNCs@PEI配体的微观变化,有助于探究其荧光猝灭的机理。AgNCs@PEI和MNZ混合物的紫外-可见吸收光谱如图7A所示,MNZ加入AgNCs@PEI 后, 在323 nm处出现一个新的吸收峰(曲线c),且此特征峰较MNZ的特征峰(318 nm, 曲线a)发生相对红移。AgNCs@PEI吸收光谱的改变可能是由于MNZ咪唑环内N原子(具有非共用电子对)易与PEI中大量氨基官能团产生较强的氢键作用,形成稳定的配合物。此配合物使PEI分子内的振动及转动加剧,导致三线激发态电子发生非辐射复合及荧光猝灭。此外,由于MNZ中含有吸电子能力很强的硝基官能团,也可能导致激发态电子发生电荷转移而出现荧光猝灭。对AgNCs@PEI加入MNZ前后的荧光寿命进行分析的结果如图7B所示,寿命拟合数据见表2,加入MNZ前后的荧光寿命基本未发生变化,说明MNZ并未影响AgNCs@PEI的光电子辐射弛豫过程[30]。

3.5 实际样品分析

采用本方法检测人尿样中的MNZ。尿样中未检出MNZ。在尿样中分别添加10.0、50.0和100.0 μmol/L MNZ标准样品,采用本方法进行测定,加标回收率在95.8%~103.4%之间,相对标准偏差 (RSDs) 均低于4.3%(表3),表明AgNCs@PEI具有良好的应用潜能。

4 结 论

合成了基于聚乙烯亚胺保护的银金属纳米簇荧光探针(AgNCs@PEI),能够在高离子强度环境中且长时间光照下稳定存在,合成方法简便、快速、成本低。AgNCs@PEI配体中的大量氨基官能团与MNZ咪唑环内N原子(具有非共用电子对)可产生较强的氢键作用,形成稳定的非辐射配合物,导致AgNCs@PEI荧光的猝灭,基于此建立了MNZ的荧光检测方法。本方法具有检出限低、灵敏度高、重现性好的特点, 并用于尿液中MNZ的检测。本方法有望拓展到疾病诊断、水质分析等领域。

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