杨树烂皮病菌的致病性及豚草抑菌研究

矫丽曼， 梁泰铭， 纪纯阳， 李晓宇， 张 妍

(1.辽宁省杨树研究所, 辽宁 盖州 115213； 2.沈阳农业大学林学院, 辽宁 沈阳 110161)

杨树烂皮病又称腐烂病，病原有性阶段为污黑腐皮壳ValsasordidaNit.，无性阶段为金黄壳囊孢菌Cytosporachrysosperma(Pers.) Fr.[1-2]。烂皮病是杨树的重要枝干病害，是潜伏侵染性病害，当出现水涝、干旱、冻害、日灼等恶劣条件，以及苗木移植或强度修剪后不易恢复树木生机时，病害便迅速发生，轻者影响树木生长，出现放叶晚、叶片变小、枯枝、枯干等病状，重者造成树木成片死亡[2-5]。

豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.，属菊科Compositae豚草属Ambrosia，又名艾叶破布草、美洲艾，一年生草本植物，原产于美国，20世纪30年代初传入我国东部沿海，现在全国范围内广泛分布[6-7]。豚草生长于荒地、路边、水沟旁、田块周围或农田中，具有生命力强、生长旺盛、适应性广、种子产量高、耗水量大和营养物质高等特点，遮盖和压抑周围的作物，阻碍农业操作，导致作物减产甚至绝收[8]。同时豚草花粉极易引起过敏反应[7]。许多学者对豚草进行了各方面的研究，豚草粗提物具有杀虫、抑菌和灭螺等多种生物活性[9-10]。

杨树烂皮病传统的防治方法是将树木病灶处用刀划开后涂碱水，效果往往不明显。用广谱的抑菌药剂虽达到较好抑菌效果，但对生态环境造成污染。本文研究了小叶杨烂皮病的致病性，并进行豚草粗提物对烂皮病及致病病斑抑菌试验，这一研究为植物源农药在林业病虫害防治中的应用提供一定的理论基础[11]。

1 试验材料

1.1 植物材料

小叶杨枝条采自内蒙古库伦旗地区，修剪后放于温室内水培。

豚草采自辽宁省盖州市高丽城和西海等地区。将采集的豚草叶片用清水洗净，放于通风阴凉处阴干，再用50 ℃烘箱烘干至恒重后，用中药材粉碎机粉碎，称重分装于棕色试剂瓶中，放于阴凉处保存备用[12-13]。

1.2 试验菌株

杨树烂皮病菌株，购自中国林业科学研究院林业菌种保存中心，编号为88513。

2 试验方法

2.1 小叶杨烂皮病的致病性试验

采取烫伤和不烫伤两种接种处理方法。接种前用75%的酒精消毒树皮表面，不烫伤接种方法是用无菌手术刀在消毒的树皮表面切去一小块韧皮部，用接种针挑取适量菌丝放于切口处，再把切取的树皮覆盖在切口上；烫伤接种方法是用已烧热的打孔器(直径5 mm)刺入枝干，然后用手术刀在烫伤处切一圆形伤口(不伤害枝条的木质部)，再将预先用打孔器(直径5 mm)打好的菌柄接种于伤口处，最后将2种接种处理方法中的切口处均用浸泡无菌水的脱脂棉包好，用保鲜膜包扎保湿。为了后期的抑菌试验烫伤接种150个，未烫伤接种60个。每3 d换一次水，每天打两次氧，保证枝条正常生长。接种3 d后拆开保鲜膜，开始观察“病斑”的发生发展情况，以“病斑”横向大小为主要标准，记录是否发病和发病症状[14-16]。

2.2 豚草粗提物对杨树烂皮病的抑菌试验

2.2.1 含豚草粗提物培养基的制备 杨树烂皮病病原菌用PDA培养基培养，采用温浸-超声波联合提取法提取豚草粗提物。将灭好菌的培养基趁热放于无菌的超净工作台中，当培养基的温度降至40 ℃左右时，将预先配置好的豚草粗提物溶液分别加入PDA培养基中，以加水为对照，使豚草粗提物在培养基中最终浓度分别为0、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mg·mL-1，混合均匀后倒入平皿，待培养基冷却后即得到含不同浓度豚草粗提物的PDA培养基，每个浓度重复6次[17-18]。

2.2.2 抑菌试验 在无菌条件下，用直径5 mm的无菌打孔器在预先培养好的杨树烂皮病病原菌菌株平面上打成圆形菌柄，用无菌镊子夹取菌柄放于含豚草粗提物的培养基中，每皿接种一块，用封口膜封好，放于25 ℃的生物培养箱中培养[19-20]。

2.2.3 统计方法 采用生长速率法测定菌丝的生长抑制率，并用DPS 18.10高级版LDS法进行数据分析[21-22]。定期观察菌丝的生长情况，待对照菌丝延伸至平皿边缘时停止生长，用十字交叉法测量菌落直径，取2次的平均值计算抑菌率[23-24]，详见式(1)和式(2)。

生长直径=测量菌丝直径的平均值-菌柄的直径

(1)

(2)

2.3 致病病斑的抑菌试验

根据试验结果和致病病斑的数量，将豚草粗提物配置成20.0、40.0、80.0 mg·mL-1浓度的溶液，以不处理的病斑为对照。对已发病的小叶杨烂皮病病斑用无菌刀片顺枝条方向刮破树皮，用小毛刷进行涂抹各浓度的豚草粗提物溶液，并在病斑边缘用圆珠笔做好标记，隔24 h再涂抹一次豚草粗提物溶液，观察病斑的变化，统计抑菌效果，计算出平均抑菌率，确定适宜的抑菌浓度[25]，详见式(3)。

平均抑菌率=(抑菌病斑数/处理病斑数)×100%

(3)

3 结果与分析

3.1 致病性试验结果

烫伤与未烫伤2种接种处理结果见表1，由表1可知，未烫伤处理的枝条均未发病，而烫伤处理的枝条发病率为92.00%，烫伤接种后5 d菌柄周围的树皮开始变成黄色，慢慢向周围扩展，接种15 d后病斑平均直径已达到19.13 mm。图1为3株小叶杨枝条烫伤接种杨树烂皮病病原菌的发病情况。

表1 小叶杨烂皮病的致病性试验结果Tab.1 Pathogenicity test results of Cytospora chrysosperma(Pers.) Fr. in P. simonii Carr.处理接种病斑数侵染病斑数发病率/%病斑平均直径/mm烫伤15013892.0019.13未烫伤6000.000.00

3.2 杨树烂皮病室内抑菌试验结果

烂皮病病原菌菌丝在含豚草粗提取的PDA培养基上生长缓慢，培养10 d对照组菌丝长至平皿边缘，此时各浓度的抑菌率见表2。由表2可知，豚草粗提物浓度为1.0 mg·mL-1时，平均抑菌率为68.32%；浓度为16.0 mg·mL-1时，抑菌率达到82.34%，且各处理间菌丝生长直径和抑菌率在0.05水平上存在显著性差异。

图2为豚草粗提物7个不同浓度处理对杨树烂皮病病原菌的抑菌效果比较，图3为16.0 mg·mL-1豚草粗提物对烂皮病的抑菌效果。由图2和图3可知，对照菌丝向外延伸至平皿边缘，产生孢子，菌落为棕色，而豚草粗提物抑制后的菌丝向外延伸很小，菌落为白色，未产孢子。通过试验得到不同浓度的豚草粗提物对杨树烂皮病有较好的抑菌作用，并随浓度的增加而增大，豚草粗提物对杨树烂皮病病原菌有较高的抑菌效果。

表2 不同浓度豚草粗提物对杨树烂皮病病原菌的抑菌率Tab.2 Bacteriostatic rate of Ambrosia artemisiifolia L.crude ex-tracts with different concentrations to the pathogen of Cy-tospora chrysosperma(Pers.) Fr.粗提物浓度/(mg·mL-1)处理10 d时菌落生长直径/mm抑菌率/%CK78.24 a0.00 f0.557.17 b26.68 e1.024.80 c68.32 d4.023.32 cd70.24 cd8.020.19 cd74.19 bc12.018.86 de75.93 b16.013.85 f82.34 a 注:同列数据后不同小写字母表示不同处理存在显著差异 (P﹤0.05)。下同。

3.3 致病病斑的抑菌试验结果

通过试验可知：3种浓度豚草粗提物对小叶杨烂皮病病斑的抑制效果均达到85%以上，40.0 mg·mL-1粗提物的平均抑菌率为91.89%，80.0 mg·mL-1粗提物平均抑菌率为92.11%，这说明从40.0 mg·mL-1粗提物开始，随着豚草粗提物浓度的增加其抑菌效果而缓慢增大，抑制后病斑直径与对照直径在0.05水平上存在显著性差异。从药剂使用量和抑菌效果综合考虑，豚草粗提物对小叶杨烂皮病病斑的最适宜抑制浓度为40.0 mg·mL-1。抑制效果见图4，抑制的病斑向外几乎无扩大。

表3 豚草粗提物对杨树烂皮病病斑的抑菌效果统计Tab.3 The bacteriostatic effect statistics of Ambrosia artemisiifolia L. extracts to Cytospora chrysosperma(Pers.) Fr.粗提物浓度/(mg·mL-1)处理病斑数/个抑制病斑数/个抑菌前病斑平均直径/mm抑菌后病斑平均直径/mm平均抑菌率/%CK25020.15 a23.47 a020.0373219.96 ab20.41 bc86.4940.0373419.63 ab19.66 c91.8980.0383519.56 b19.58 c92.11

4 结论与讨论

通过研究，得到了烂皮病对烫伤接种处理的小叶杨枝条有较高的致病性，豚草粗提物对杨树烂皮病及致病病斑具有较好的抑菌效果，并随其浓度的增加抑菌率而增大。

试验材料小叶杨，属于青杨派树种，树皮光滑易染病，便于观察。致病性试验选用了烫伤和未烫伤两种接种处理方法，烫伤接种处理的枝条发病率为92.00%，而未烫伤接种处理的枝条均未发病。可见在室内枝条致病性试验中烫伤接种处理是烂皮病侵染的必要条件，烫伤可使伤口周围达到无菌的环境，浸水脱脂棉保持菌丝生长的湿度，周围环境保证菌丝生长的温度，这些都有利于接种病原菌在枝条上侵染生长。崔永亮等[26]以病斑愈合率为指标。本试验枝条属于离体水培，培养到一定时间，因营养条件不足枝条枯萎，致病病斑经豚草粗提物处理后未达到愈合的程度，所以本试验以平均抑菌率为主要指标确定抑菌效果。在原有试验基础上，还需研究杨树烂皮病对其他派杨树品种的致病性，得出侵染规律，利于后期开展野外林地的抑菌试验。同时还需开展豚草粗提物与广谱杀菌剂抑菌效果比较。

前人已经开展了豚草粗提物对杨树烂皮病的室内抑菌试验，笔者在前人研究基础上开展了小叶杨离体枝条烂皮病的致病性和豚草粗提物对小叶杨烂皮病致病病斑的抑菌作用研究，以期为豚草粗提物用于林业病害的野外防治及果树、一些观赏树木病害防治提供前期的试验基础，为确定用于生产和防治工作的新型植物源农药提供前期研究基础，对推进无公害农药的研究和应用有着重大的意义。