NAFLD对大鼠葡萄糖、胰岛素代谢和肝糖原合成的影响

张学峰,杨光旭,朱友,张丹丹,夏金荣,李卫东

(1．东南大学附属中大医院江北院区 消化科，江苏 南京 210048；2.东南大学附属中大医院 消化科，江苏 南京 210009)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤[1],已成为全球第一大肝病[2]。NAFLD与2型糖尿病有因果联系，其联系的共同环节是IR[3- 5]。而IR的实质是肝脏、肌肉和脂肪等外周组织对胰岛素敏感性减弱，表现为高血糖和高胰岛素血症[6]。肝脏作为物质、能量和激素代谢的枢纽，发生NAFLD后肝脏的代谢能力可能会有变化。本研究通过动物实验探索NAFLD对大鼠葡萄糖、胰岛素代谢和肝糖原合成的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠24只(购于上海凯学生物科技有限公司)，8～12周龄，体重230～260 g，在温度控制于(22±1)℃的动物饲养中心喂养。

1.2 试剂

胰岛素ELISA试剂盒购自美国EMD Millipore公司,血糖检测试剂盒购自美国Abbott Pharmaceutical公司，糖原检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，抗-AKT抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,抗p-AKT抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，抗-GSK3β抗体购自美国Boster Biological Technology公司，抗-p-GSK3B抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,抗-actin抗体购自英国Abcam公司，二抗购自美国Novus Biologicals公司。PCR引物G6Pase-F 5′-AAGCCAACGTATGGATTCCG-3、G6Pase-R 5′-ACAGCAATGCCTGACAAGACT-3′,PEPCK-F 5′-GTGCTGGAGTGGATGTTCGG-3、PEPCK-R 5′-CTGGCTGATTCTCTGTTTCAGG-3′,PGC-1α-F 5′-CAATGAATGCAGCGGTCTTA-3′、PGC-1α-R 5′-GTGTGAGGAGGGTCATCGTT-3′和逆转录酶购自美国New England BioLabs公司。

1.3 NAFLD大鼠模型的建立

SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为模型组即高脂(hige fant diet，HFD)组和对照(control diet，CD)组，各12只。HFD组用88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇喂养，CD组只用基础饲料喂养，均自由饮水、进食。持续喂养30 d，分别在第5、10、15、20、25、30天每组随机选10只大鼠尾静脉取血，检测随机血糖水平；第30天加测胰岛素水平，且每组选择2只大鼠断颈处死，取部分肝脏切片行油红O染色和HE染色；其余肝组织置-80 ℃液氮中保存。

1.4 HE和油红O染色

4%多聚甲醛灌注固定，取固定好的肝脏组织进行常规HE染色。油红O染色需先配制油红O饱和液，即0.5 g油红O充分溶于100 ml异丙醇中，按饱和液与水3∶2的比例配制成染液。取肝脏组织行厚度为8 cm 的冷冻切片，染色20 min，苏木素复染核25 s，1%盐酸分化后用流水冲洗反蓝，甘油明胶封片后镜下拍照观察。

1.5 肝静脉血葡萄糖、胰岛素、肝脏糖原检测

持续喂养30 d后，HFD组和CD组各取10只大鼠，禁食12 h后恢复大鼠饮食，分别在0、30、60、120、180 min 5个时点每组断颈处死2只大鼠，切开腹壁，肝静脉穿刺取血检测血糖浓度和胰岛素水平，并取部分肝脏组织检测肝脏糖原含量，检测步骤严格按试剂盒说明书操作。

1.6 糖原合成相关蛋白磷酸化水平检测

取液氮保存的HFD组和CD组大鼠肝组织，冰上称取100 mg肝组织剪碎放入研钵中，充分研磨组织，冰上裂解20 min，旋涡混合仪上电动30 s，重复4次，然后移1.5 ml至离心管中，4 ℃ 12 000 r·min-1离心30 min后收集上清液。采用SDS-PAGE凝胶电泳法测定，每道加50 μg蛋白，用积层胶和分离胶电泳，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，30 mA通电3 h，含3%牛血清白蛋白的TBST室温封闭2 h。用一抗4 ℃孵育过夜，相应的二抗室温孵育1.5 h，然后用TBS洗3次，每次10 min，采用化学发光法检测肝组织中蛋白激酶B(AKT)和糖原合酶激酶3β(GSK3B)的蛋白磷酸化水平。

1.7 糖异生相关酶G6PASE、PEPCK和PGC1a的基因表达

采用Trizol一步法提取细胞总RNA，于含0.5 μg·ml-1EB的1%琼脂糖凝胶电泳30 min(100 V)，检测RNA有无降解。用紫外分光光度计测定RNA的含量和纯度。每份样品取1 μg RNA进行逆转录合成cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，由电脑自动分析并计算出反应体系中待测样本cDNA达到设定阈值的循环数(Cycle Count，Ct)。根据Ct值比较基因的表达量。各目的基因表达水平差异的比较：变化倍率=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因)。检测肝组织中糖异生关键酶G6PASE、PEPCK和PGC1a的基因变化。

1.8 统计学处理

实验数据用GraphPad 5.0进行分析，各组计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 成功建立NAFLD大鼠模型

两组大鼠0、5、10、15、20 d随机血糖无差异(P>0.05)，而25、30 d HFD组显著高于CD组(P<0.05，图1A)；HFD组大鼠30 d的胰岛素水平显著高于CD组(P<0.05，图1B)。油红O染色显示HFD组肝组织有大量脂肪颗粒(图1C)，HE染色显示HFD组大鼠肝组织有大量空泡细胞(图1D)，均为NAFLD的表现。上述结果表明，通过高脂饮食喂养30 d，HDF组大鼠成功构建了NAFLD模型。

a P<0.05

2.2 肝静脉血葡萄糖、胰岛素代谢和肝糖原测定结果

绘制HFD组和CD组大鼠葡萄糖、胰岛素代谢曲线(图2A、B)及肝糖原存储曲线(图2C)，结果显示，HFD组的葡萄糖、胰岛素水平均显著高于CD组(P<0.05)，而HFD组的肝糖原水平显著低于CD组(P<0.05)。

a P<0.05

2.3 糖原合成蛋白和糖异生相关酶的基因表达

HFD组肝脏的糖原合成相关酶AKT和GSK3B的蛋白磷酸化(p-AKT和p-GSK3B)受到抑制(图3A)，而HFD组糖异生相关酶基因G6PASE、PEPCK和PGC1a的表达水平则显著高于CD组(P<0.05,图3B)。

a P<0.05

4 讨 论

肝脏作为物质代谢、能量代谢和激素代谢的主要器官，接受经门静脉系统传输的各种物质，包括葡萄糖和胰岛素等。葡萄糖进入肝脏可以被氧化产能、合成糖原或进入肝静脉；胰岛素进入肝脏可以被肝细胞降解、合成肝糖原被消耗或进入肝静脉。因此，检测肝静脉的葡萄糖和胰岛素水平能反映肝脏的糖代谢状态。本研究通过绘制NAFLD大鼠的葡萄糖、胰岛素和糖原合成曲线，显示HDF组的肝静脉血糖和胰岛素水平增高，表明NAFLD大鼠葡萄糖和胰岛素的代谢能力降低，提示NAFLD大鼠出现了肝脏IR，肝静脉血中增高的血糖和胰岛素会进入全身循环，可能参与全身IR和2型糖尿病的发生。赖水青等[7- 9]研究发现，肝脏脂肪含量与IR、糖代谢异常发生密切相关；袁静等[10]研究还发现,高脂肪诱导的肝脂肪变性过程中，葡萄糖调节蛋白GRP94表达升高，NAFLD合并糖代谢异常。本研究结果与之一致。

门静脉血糖增高时，胰岛素通过促进肝糖原合成、抑制糖异生两个途径控制葡萄糖，维持肝静脉血糖的稳定。本研究通过RT-PCR和Western blotting检测发现，HFD组NAFLD的糖原合成相关酶的基因磷酸化水平较CD组明显降低，肝脏糖异生酶的基因表达反而增强，从分子水平表明NAFLD时胰岛素促进肝糖原合成和抑制糖异生能力均降低，从而导致肝静脉血糖增高和肝糖原储备减少。有研究发现糖异生调控的失衡是2型糖尿病的典型特征[11]，本研究发现NAFLD也存在糖异生调控失衡。针对NAFLD糖异生调控的基因靶点进行治疗，也许是早期干预2型糖尿病的方法[12]。

本团队前期病例对照研究和队列研究结果显示，NAFLD是2型糖尿病的独立危险因素，NAFLD患者2型糖尿病的4年累积发病率是非NAFLD者的4.3倍[13- 14]，降低NAFLD的发病可以减少72.58%的2型糖尿病发病，已经从流行病学研究上提示NAFLD与2型糖尿病有因果联系[15- 18]。本研究通过动物实验和分子生物学方法阐明NAFLD与2型糖尿病的内在联系，NAFLD肝脏调节葡萄糖、胰岛素能力下降，肝糖原合成减少，导致高血糖和高胰岛素血症，引起IR并增加患2型糖尿病的危险。