铝与阿尔茨海默病发生间关系的研究进展

孟雪莲，苏书杰，冯琳琳，陈长兰

(辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036)

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，又叫老年痴呆症，是一种可引起脑功能逐渐衰退的神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases).在病理学上，AD主要以脑实质组织中由神经元细胞外Aβ(β amyloid peptide，Aβ)多肽聚集形成的老年斑沉积，和神经元细胞内磷酸化Tau蛋白形成神经元纤维缠结(Nerve fiber tangles，NFTs)以及海马和大脑皮质区神经元突触的选择性丢失为病理学标志特征[1].流行病学研究表明，在65岁以上的老年人中AD的发病率为2～5%，以后每5年上升一倍，在85岁以上的老年人中发病率高达47%，严重影响老年人的生活质量[2].目前我国已经逐步进入老龄化社会，为此研究AD的发病机理及防治措施具有重要意义.AD发生的影响因素较多，关于AD的发生机制有很多学说，比较公认的有β淀粉样多肽级联假说、Tau蛋白假说、胆碱能假说、氧化应激假说、炎症反应假说、神经血管假说和代谢假说等[3].

铝(Al)是地球上最为丰富的金属元素之一.由于铝及其化合物是水、食物、餐具、茶、调味品、除臭剂、食物添加剂、化妆品及医药中最常见的污染物，因此非常容易被人体误食及在人体中发生积累[4].铝不是生物生活必需的元素，相反，大量证据表明铝具有神经毒性并与一些疾病如阿尔茨海默病(AD)，肌萎缩(ALS)，帕金森综合症(PD)和波斯湾战争综合症等神经退行性疾病的发生密切相关[5].

AD发生的铝假说是上世纪60年代基于铝的神经毒性、解剖学和流行病学发现所提出的，认为铝是导致AD发生的因素之一[6].在过去的几十年中铝假说经历了很多争论和质疑.但近年来随着对疫苗中铝佐剂作用机制的研究，重新引起对铝与Aβ间相互作用机制及铝与AD等神经疾病发生关系以及小胶质细胞在其中所扮演关键角色的重视.

近期 Morris G 等(2017)所进行的截止到2015年8个队列，10 567个参与者的元分析表明，铝暴露程度的提高使得AD风险增加了71%.对AD患者脑、血清和脑脊液中的铝含量的元分析(meta-analyses)表明，上述组织中的铝含量显著升高[7].非痴呆老年人脑部灰质的铝含量一般在1～2.5 μg Al/g脑组织(干重)，而AD患者这一区域的铝含量一般要高出2～3倍，达3～7 μg Al/g脑组织(干重)[8，9].Mirza A等(2017)对 12 个家族性AD患者的研究表明，脑组织中的铝含量非常高，5个病人脑组织中铝含量达到 10 μg/g(脑组织干重)，脑组织中的铝含量比任何其他疾病脑组织中的铝含量都高，仅次于铝诱导产生的脑病[10].

有越来越多的证据表明脑部铝过量积累与 AD 的发生密切相关.近期对铝与Aβ作用机制的最新进展重新引起对铝与AD等神经系统疾病关系的重视.因此研究铝致AD的发生机制不仅对科学预防AD的发生具有重要的科学意义和临床价值，而且对于AD的治疗及药物研发具有重要的科学意义.

1 铝与蛋白及多肽作用方式研究进展

免疫佐剂被广泛用于疫苗当中，因为铝佐剂能够加强适应性免疫反应.颗粒状铝盐作为被批准的佐剂用于疫苗当中已有80多年.上述佐剂主要包括氢氧化铝(一种晶状化合物)，羟基磷酸铝和磷酸铝等.铝能够吸收抗原到其表面，而铝颗粒能够被单核、巨噬细胞等吞噬细胞所吞噬.由于佐剂能够在淋巴结中迁移，可以通过单核细胞相连的细胞散布到身体内，并逐渐在脑中聚集而引起高度重视[11].

Al3+与Mg2+、Fe3+其它金属离子相比，或有更强的正电荷，或有较小的离子半径，因此Al3+能够与蛋白或多肽中带负电荷的天冬氨酸、谷氨酸残基或磷酸化的氨基酸残基牢固结合从而扮演交联剂的作用，因此Al3+能够导致蛋白及多肽的低聚化及构象变化，从而阻止蛋白酶对蛋白的降解[12].

2 铝与Aβ多肽作用方式研究进展

进一步研究发现，与铝佐剂增强抗原免疫原性机制相似，Al3+以及Zn2+、Cu2+、Fe3+等金属离子具有促进Aβ多肽低聚化及影响其构象的作用[13-14].Aβ蛋白是由淀粉样蛋白前体(β-amyloid precursor protein，APP)经过β-APP剪切酶(BACE)对APP的N末端剪切，及γ-分泌酶经对APP的C末端剪切而产生的39～43氨基酸残基的多肽.它是一种疏水多肽，具有一种自我聚集和在水溶液中形成SDS稳定低聚物的固有趋向.其单体形式是一种随机缠绕结构，其低聚态具有β折叠片结构，并形成不溶的淀粉样纤维聚集物，且随着时间老化其神经毒性增加.因此促进或者抑制低聚化的因素将会在AD发生过程中发挥重要作用.Kawahara M等(2011)的研究表明，Al能促进Aβ蛋白的聚集及SDS稳定低聚物的形成，Al3+促进聚集的作用强于Zn2+、Fe3+、Cu2+和Cd2+，通过添加Al螯合剂去铁胺(Deferoxamine，DFO)，聚集的Aβ蛋白可以解聚，进一步证明了Al在Aβ蛋白聚集中的作用[15].

另外铝还可以促进神经元细胞中APP的基因表达，长期铝摄取过多可以导致大鼠中APP蛋白表达量的升高[16-17].

以往由于脑组织中铝积累染色技术的缺陷导致部分学者在AD患者及同龄对照间未发现铝与Aβ共沉积现象.但近年来随着一些脑组织中铝染色技术的进步，很多学者都在AD患者脑组织、Aβ聚集核心区发现了铝积累.最近Yumoto等采用X射线光谱结合透射显微镜研究发现，在老年斑中Al的含量可达35～50 ppm[18].Platt B等(2001)通过Al的荧光Morin染色研究发现，Al集中于纹状体、胼胝体和扣带束的白质区(白质区小胶质细胞和星形胶质细胞丰富)，对小胶质细胞和星形胶质细胞免疫组化研究表明铝注射动物与对照相比，具有强烈的炎症反应.通过乙酰胆碱酶标记发现铝注射动物扣带束的破坏导致皮质和海马胆碱能末梢发生严重的进行性变性[19].脑组织铝显色最新技术表明，铝存在于Aβ沉积的核心.脑组织中铝沉积显色新技术的进步进一步证实了Al3+在Aβ多肽聚集及AD发生中的重要作用.

3 铝与Aβ多肽相互作用对神经细胞的毒害研究进展

Ricchelli F等(2005)研究认为，Al3+能导致Aβ1-40及Aβ1-42产生更多β片层结构及形成暴露的疏水簇，导致更多生成纤维形式的多聚物.Al3+比Zn2+和Cu2+在导致Aβ聚集和纤维化方面更为高效.通过脂质体膜模型研究发现，Al3+-Aβ能够导致脂质双分子层发生剧烈变化[20].Song J和Niu Q等(2014)，Zhang QL和Niu Q等(2008)研究认为在铝处理的大鼠中铝通过破坏神经细胞及内质网的可塑性和诱导神经坏死损害海马依赖的学习和记忆能力[21，22].

Kawahara M等(2001)研究发现在含铝溶剂中聚集产生的Aβ多肽在培养神经元细胞的表面形成纤维沉积[23].Drago D等(2008)分别就Aβ-Al，Aβ-Zn，Aβ-Cu，Aβ-Fe复合物对人神经母细胞瘤的生活力、膜结构和细胞形态的影响进行了研究.研究发现Aβ-Zn、Aβ-Cu和Aβ-Fe对人神经母细胞瘤没有细胞毒性，而Aβ-Al能够降低细胞的生活力，增加膜的流体性，细胞形态发生重要改变.另外铝与Aβ的结合变得强烈疏水，表现出很大的细胞毒性[24].多个实验室的研究表明Aβ多肽能够在脂质双分子层、脂质体、神经元、卵母细胞和内皮细胞中形成离子通道.这些通道具明显的生理特征，与其毒性特性相一致.这些Aβ通道在大小、选择性、抑制剂和开放性上具很大差别，一般具有作用较大，不依赖电压，离子选择性较弱等特点，导致Ca2+、Na+、K+、 Cs+、Li+及Cl-等的内流及外流，从而影响神经细胞的功能[25].

Aβ 聚合物与神经元细胞膜具有较强结合能力，Al3+-Aβ聚合物赋予Aβ聚合物更强的与神经元细胞膜的结合能力导致神经元细胞的损伤，这方面研究资料较为丰富，本文不再赘述.慢性铝中毒导致钙离子外排主要通道蛋白Ca2+、ATPase活性降低，而钙离子摄取通道蛋白voltage-operated calcium channels 显著升高，细胞内钙离子水平升高，钙依赖蛋白水解酶Calpain活性显著增加[26，27].APP或者Aβ 能够引起Calpain表达量的升高.而AD病人与同龄对照相比m-Calpain升高7倍[28].但是YanD和Cai Y等(2017)研究发现，亚慢性铝暴露损害了体内的学习和记忆能力，削弱了细胞内Ca2+和cAMP的信号水平，降低了TORC1核易位，降低了SIRT1、TORC1和pCREB的含量，最终降低了BDNF mRNA水平[29].

4 铝与磷酸化Tau作用方式研究进展

Tau蛋白是微管结合蛋白(Micro tubuli-associated protein，MAP)中的一种，正常Tau蛋白的作用是和管蛋白结合形成微管并维持微管的完整性和稳定性，在中枢和外周的神经系统中含量丰富，可有6种不同的异构体[30].Tau蛋白被高度磷酸化以后将失去与微管的结合能力形成异常修饰聚集的Tau蛋白而导致神经元功能障碍[31].Shin等研究发现，铝可以选择性与高度磷酸化Tau蛋白结合，诱导这些蛋白质聚集并抑制其水解，从而诱导它们形成NFTs.并且铝和异常磷酸化的Tau蛋白在NFTs内可共同定位，推测铝与磷酸化Tau蛋白的结合促进了NFTs的产生[32].Walton等进一步证实铝与过磷酸化Tau蛋白在大脑海马组织的NFTs中存在共定位现象[33].

磷酸化的Tau蛋白由于大量负电荷的存在，对Al3+变得尤为敏感，对铝的敏感度提升了3.5个单位.在螯合剂EDTA存在时，铝诱导的Tau蛋白聚集为可溶的，而产生的磷酸化Tau蛋白聚集是不可溶的，且对蛋白质水解作用也不敏感[34，35].Tau蛋白磷酸化后就失去了与管蛋白的结合能力，为维持围观的完整性和稳定性必须产生更多的Tau蛋白，这些新产生的Tau也逐步的磷酸化，导致磷酸化Tau蛋白进一步增加[36].

PP2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是哺乳动物脑部从磷酸化Tau蛋白中移除磷酸根的最主要的酶，AD患者脑部往往表现出PP2A活性受到抑制[37]，铝能通过抑制PP2A的活性从而促进磷酸化Tau蛋白的增加，磷酸化Tau蛋白是成熟NFTs产生的关键因素[38].免疫组化实验显示，很少量的铝足以抑制PP2A的活性[39].

Kov′acs等应用Aβ和Tau蛋白免疫组化方法研究发现，15位AD患者中全部检测到NFTs和弥散的、原始的、典型的及致密的Aβ沉积.但在15位老年非患者对照中，仅有13位(87%)在大脑的嗅球部位检测到NFTs，而仅仅5位(33%)含有弥散的Aβ沉积.并认为NFTs的产生早于Aβ沉积[40].淀粉样蛋白级联假说则认为Aβ沉积的出现早于NFTs的出现，并认为前者导致后者的形成[41].Price等观察发现Aβ沉积在颞皮层的出现要早于NFTs的出现[42].但一些学者研究认为，大脑边缘区域Tau病理学比Aβ病理发生平均要早至少27年[43，44].

5 铝对 Aβ 多肽与 Fibrinogen 相互作用影响研究进展

以往关于AD发生机制的研究比较重视Aβ产生及聚集对脑实质组织的影响，而对血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)通透性及脑毛细血管血流的研究相对忽视.而实际上AD既存在脑实质组织细胞外Aβ聚集也存在脑血管壁上Aβ的聚集.

AD患者的一个常见病理学特征是在毛细血管、动脉和小动脉壁上发生的 Aβ多肽沉积，被称为脑淀粉样血管病.AD是一种神经退行性疾病，血管病理学在其中起着重要作用.在AD患者中经常发生脑血管功能障碍.AD患者往往发生脑血流减少及变化，慢性脑灌注不足经常与 AD发生相联系，因此循环系统出现的问题在AD发生过程中扮演重要角色，神经元损伤和记忆缺陷有可能是血管问题所导致的[45].纤维蛋白原(Fibrinogen)是一种 340 kDa血浆糖蛋白，在血液中以微摩尔级浓度存在，在凝血过程中起关键作用.在凝血酶的剪切下，纤维蛋白原转化为纤维蛋白，聚合成纤维蛋白网络及凝块.纤维蛋白原通过为激活的血小板提供桥梁促进血小板的聚集，从而为凝固提供必要条件，纤维蛋白凝块的溶解由纤溶酶原所介导[46，47].

越来越多的证据表明Fibrinogen相关的循环系统障碍在AD中起着重要作用.Aβ和Fibrinogen之间的相互作用，将诱发抗血纤维蛋白溶酶的异常血液凝块，延迟纤维蛋白溶解，增加炎症，使认知功能丧失.Aβ寡聚物比Aβ单体对Fibrinogen具有更强的亲和力.Singh PK等(2018)测试了Aβ聚合抑制剂Aβ-Fibrinogen交联的阻滞祖婆用，发现一些既能抑制Aβ聚合又能抑制Aβ-Fibrinogen交联的抑制剂[48].Hyung JA等(2011)发现经高通量筛选所获得的RU-505既能显著减少脑皮层血管淀粉样蛋白沉积和小胶质细胞增多症，也进一步改善了AD小鼠模型的认知损伤[49].Zamolodchikov D等(2018)研究发现，Aβ1-42的中心区域与Fibrinogen的D片段相结合，并导致导致Fibrinogen的C末端发生结构变化[50].Cortes-Canteli M等(2010)对其与AD中纤维蛋白凝块形成的关系进行了研究.体外和体内实验表明，在Aβ存在情况下，纤维蛋白凝块结构异常并难以降解.对血栓形成和溶解的脑内成像显示AD小鼠血栓形成和纤溶作用存在异常.此外，在AD小鼠中，减少纤维蛋白原能够降低脑淀粉样血管病变的病理改变和认知功能减退[51].Chen SM等(2013)对由AlCl3诱导产生的大鼠神经病理改变研究结果表明，AlCl3注射增加Aβ斑块积累，引起红细胞变形能力下降，红细胞聚集增加，氧气传输效率降低、Fibrinogen浓度增加，血液粘度增加等一系列改变血液流变学参数的变化[52].Bhattacharjee S等(2013)研究发现，在AD患者中，在从大动脉到为海马体提供血液的后大脑动脉中铝浓度呈现梯度增加的趋势，细胞培养发现，血管内皮细胞比脑组织的其它细胞具有更强的铝吸附能力[53].

通过以上分析可以看出，前人研究工作说明AD患者脑部血管壁上能产生Aβ聚集，Aβ通过与Fibrinogen的相互作用能够促进脑血管中纤维蛋白凝块的形成及红细胞的聚集.脑血管内皮细胞对铝具有很强的吸附能力，因此铝有可能促进Aβ在脑血管壁上发生聚集，形成更多的Al-Aβ低聚物.由于红细胞占到血液体积的40%以上，Al通过促进Aβ与Fibrinogen的相互作用有可能进一步加剧脑血管中纤维蛋白凝块的形成及红细胞的聚集，导致毛细血管血流发生更大变化，甚至导致脑组织局部缺氧，引起AD的发生.

6 对铝在大脑中蓄积及铝中毒的预防

由于铝进入脑部的量远大于离开的量，结果极易导致导致随着时间推移铝在脑部的净积累，铝是唯一常见的随着年龄增长在脑部蓄积的神经毒素[54，55].肠道对铝的吸收率越高脑部铝的含量越高[56]，所以应该尽量减少在铝中暴露的机会.铝可以通过BBB、脉络丛和鼻腔等三种途径通过体循环或吸收部位进入大脑[57].由于Al3+与Fe3+的相似性，负责Fe3+离子运输的细胞蛋白往往不能很好地区分Al3+与Fe3+[58]，铝的代谢与铁的代谢交织密切.

在环境中有很多因素可以促进铝进入大脑的进程.如BBB通透性的增加，柠檬酸和甲状旁腺激素(PTH)，以及维生素D等都会影响到铝进入大脑.近年来随着铝制炊具使用的减少，很多人认为人类对铝的摄取减少了.而实际情况是近年来人类对铝的摄取反而增多了，因为饮用水、作物、加工食品及铝制容器均可成为人类摄取铝的来源.1989年世界卫生组织和联合国粮农组织提出人体铝的暂定摄入量标准为7 mg/kg，1994年我国提出面制食品中铝的限量卫生标准为≤100 mg/kg[59].

饮用水中的铝多为游离型，游离型的铝分子量小，较易吸收，易通过肠壁进入血液，因此饮用水是人类对铝摄取的一大来源.若使用含铝的混凝剂或明矾来净化水质，则会增加水中的铝含量.环境污染的加重，酸雨的增多增加了土壤中铝的溶出.输水系统中混凝土管、陶土管、水泥管等一般含有铝元素，提高了给水管网末梢出水的铝含量[60].

一些食用作物对铝具有很强的吸收和积累.刘文涵等对5份甘薯样品检测发现其铝含量高达(190.8±1.59) mg/kg[61].一些面制加工食品如油条、粉丝、糕点、挂面等，尤其是油条和粉丝，由于在加工过程中使用了含铝添加剂作为膨松剂，铝含量常常含量过高，不仅超过联合国推荐摄入标准，甚至超过我国食品限量使用标准多倍.红薯粉和粉丝制作中铝的来源为超量使用明矾所致，食品添加剂中使用硫酸铝钾、硫酸铝胺等含铝膨松剂所致[62-63].高志胜等对江苏一些地区面食中铝含量进行了检测，结果显示，油条中铝的平均含量为495.6 mg/ kg，最大值达到1 538.7 mg/kg，平均值超过限量标准5倍，超过联合国推荐摄入标准的71倍[62].颜代英等检测发现，红薯粉和粉丝中铝的平均含量分别为269.26和108.58 mg/kg，红薯粉平均值超过限量标准2.7倍，超过摄入量联合国推荐摄入标准的38.4倍[62，63].

铝制炊具、容器也是人体摄入铝的重要来源.在使用铝炊具时如果接触酸(醋)、碱、盐等可使大量铝离子进入食物中.铝制易拉罐盛装啤酒、饮料，会使溶出的铝进入人体[60].此外一些药物中如胃药代表Al(OH)3等也含有铝，，长期服用这些药物也会造成铝在人体内的过量积累.

铝摄入过量，除了具有前面提到的导致AD产生等神经系统毒性作用外，还具有免疫毒性、生殖毒性、成骨毒性等各种毒性[60].为此避免过度摄入及接触铝已经成为AD及其它疾病防治的重要课题之一.

通过以上分析可以发现，铝在AD的发生过程中具重要作用.通过控制铝摄入防治AD的发生具有重要理论和临床意义.