黄酮类化合物对铜绿微囊藻的抑制作用

邢春玉 孙浩晨

（天津天狮学院 天津 301700）

目前，针对蓝藻水华的控制技术可以归纳为物理、化学、生物三类，各类技术均有明显的特点，但也均存在一定的局限性。物理方法可分为工程除藻和直接物理除藻，虽然见效快，但耗费人力、物力，且易复发[1-2]；化学方法往往只能短期奏效，且容易造成“二次污染”[3]；生物方法强调的是整个生态系统的管理，从营养环节来控制蓝藻生长，具有经济、高效、环保的优点。水生植物对蓝藻的抑制可以通过营养竞争、调节水体的氮磷比例来实现，还可以通过其分泌的化感物质来显著抑制蓝藻生长[4-6]。化感物质在水体生态修复中的应用研究备受关注，酚酸类、黄酮类、生物碱类等物质是目前发现数量最多且活性较强的化感物质[7-9]，其中黄酮类化感物质具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，在控制水华藻类方面得到了越来越广泛的研究和关注[10]。文章选取芦丁和槐米中提取的黄酮类化合物进行抑藻试验，通过研究其对铜绿微囊藻藻细胞密度和叶绿素a含量的影响，为蓝藻水华的治理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验所用铜绿微囊藻（型号FACHB-1328 ）购于武汉水生生物研究所淡水藻种库，芦丁标准品（UV≥98 %）购自天津市盛淼科技有限公司，槐米购买于中药市场。

1.2 研究方法

1.2.1 铜绿微囊藻的扩大培养

将藻种接种到BG11 培养基中，在温度为25 ±1℃，光照强度4 000 lx，光暗比为12 h∶12 h 条件下培养，每4 h 摇动一次，培养3～4 d 达到对数期，进行试验。

1.2.2 试验设计

（1）芦丁对铜绿微囊藻的抑制作用研究

配置芦丁BG11 溶液，使其浓度为45 mg/L、75 mg/L、105 mg/L，经0.22 µm 滤膜除菌。在无菌条件下准确吸取除菌后的芦丁BG11 溶液10 mL 和处于对数期的藻液40 mL加入100 mL BG11 培养基中，使得藻液中芦丁最终浓度为3mg/L、5mg/L、7mg/L。铜绿微囊藻的初始藻密度为0.15×105cells/mL。接种后在温度为25 ±1℃，光照4000 lx，光暗比为12 h∶12 h 的环境条件下培养。每天测定其藻细胞密度和叶绿素a 含量，观察铜绿微囊藻的生长情况。

（2）槐米黄酮化合物对铜绿微囊藻的抑制作用研究

准确称取经干燥、粉碎后的槐米1 g、2 g、4 g。按照料液比1∶20 加入60 %的乙醇溶液，60 ℃下水浴处理30 min，在超声温度为60 ℃，功率为200 W 的条件下提取30 min 后，将提取液置于4 000 r/min 的离心管中离心10 min，取上清液于旋转蒸发仪中浓缩。待浓缩后倒入100 mL BG11 培养基，摇匀后经0.22 µm 的滤膜除菌。在无菌条件下准确吸取除菌后的槐米BG11 溶液10 mL 和处于对数期的菌液40 mL 加入100 mL BG11 培养基中，设置一个空白对照，3 个处理组中黄酮浓度分别为5.28 mg/L、8.94 mg/L、11.86 mg/L。每隔24 h 测定其藻细胞密度和叶绿素a 的含量。

1.2.3 试验指标的测定方法

（1）藻细胞密度的测定

取摇匀后的藻液，采用25×16 型号血球计数板进行计数。藻类抑制率公式为：IR=(1-Nt/Mt)×100 %，式中IR为抑制率，Nt为处理组第t 天藻细胞密度，Mt为对照组第t 天藻细胞密度。

（2）叶绿素a 含量的测定

取铜绿微囊藻藻液10 mL 置于离心管中，4 500 r/min 离心10 min，取底部藻细胞置于研钵中，进行研磨，分3 次加入95 %乙醇，使总体积为10 mL。提取叶绿素后置于4 000 r/min 的离心管中离心10 min，取上清液，以95 %乙醇做空白对照，分别在波长665 nm、649 nm 下测其吸光度值。根据公式Ca（mg/L）=13.95 OD665-6.88 OD649计算叶绿素a 的含量。

（3）芦丁及槐米黄酮化合物含量的测定

采用分光光度法测定芦丁及槐米总黄酮的含量[11]。

1.2.4 数据处理与分析

利用Excel 软件进行数据统计分析，采用sigmaplot 12.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 芦丁对铜绿微囊藻藻密度的影响

从图1可以看出，不同浓度芦丁对铜绿微囊藻均表现出抑制作用。随着培养时间的延长，芦丁对铜绿微囊藻抑制作用明显增加，在芦丁浓度为7mg/L 处理组中，培养7d后，铜绿微囊藻抑制率可达到57.23 %（见表1）。

表1 芦丁对铜绿微囊藻的抑制率（%）

2.2 槐米黄酮对铜绿微囊藻藻密度的影响

图2显示了不同浓度槐米黄酮提取物对铜绿微囊藻的影响。在藻类培养初期，对照组和处理组中藻细胞密度差别不大，从第3 天开始对照组中藻细胞呈指数增长，处理组藻细胞增长缓慢。11.86 mg/L 槐米黄酮对铜绿微囊藻的抑制率可达到73.20%。

表2 槐米黄酮化合物对铜绿微囊藻的抑制率（%）

2.3 芦丁对铜绿微囊藻叶绿素a 含量的影响

叶绿素a 含量的变化可以揭示出藻类的生长情况，如图3所示，不同浓度芦丁处理组中铜绿微囊藻中叶绿素a 含量均显著低于对照组，对照组中叶绿素a 含量一直保持较高的水平。说明芦丁可以进入藻细胞，破坏藻类的光合系统，引起叶绿素a 的降解，以此来抑制藻类的生长。

2.4 槐米黄酮化合物对铜绿微囊藻叶绿素a 含量的影响

加入槐米黄酮化合物的铜绿微囊藻处理组和对照组藻叶绿素a 含量变化如图4所示。培养7 d 后，对照组中叶绿素a 的含量明显增加。与对照组相比，处理组中叶绿素a 含量表现出升高缓慢或下降的趋势。从图4可以看出3 个处理组中叶绿素a 含量变化与藻密度的变化趋势基本一致。

3 结论

本研究中芦丁及槐米中提取的黄酮类化合物对铜绿微囊藻均表现出一定的抑制作用，根据藻细胞密度和叶绿素a含量变化来揭示黄酮类物质对藻类的抑制情况，得出如下结论：

（1）芦丁对铜绿微囊藻的生长具有抑制效果，在不同浓度下抑制效果不同：浓度越高，对藻类的抑制效果越明显，使得藻细胞密度降低，叶绿素a 含量下降。

（2）槐米中提取的黄酮类化合物对铜绿微囊藻的生长亦具有抑制效果，且抑制作用较强；在11.86 mg/L黄酮类化合物培养藻类7 d，抑制率可达到73.20%。

（3）黄酮类化合物可通过影响铜绿微囊藻的光合作用系统来抑制其生长。黄酮类化合物的存在会降低蓝藻细胞的叶绿素a 含量，通过降低藻细胞的光能利用率从而影响其光合作用。

本研究中芦丁及槐米黄酮化合物能有效抑制铜绿微囊藻的生长，因植物中提取的黄酮类化合物本身具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，且成本低，不会引发水环境污染，因此可广泛运用到蓝藻水华的治理中。