肌酸激酶同工酶质量法的优势及其性能评价研究

陈绮婷 李琳

[摘要] 目的 对北京九强生物技术有限公司肌酸激酶同工酶CKMB测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）进行性能评价。方法 自2019年5～12月期間采用东芝2000FR全自动生化分析仪，检测肌酸激酶同工酶的准确度、精密度、线性范围、空白检测限、最大稀释倍数、临床可报告范围、参考范围进行实验性能验证。统计学方法采用直线相关回归分析。 结果 北京九强CKMB试剂盒的准确度验证中测定值与定值的相对偏差分别为0.62%、-2.89%，批内精密度CV分别为1.29%、0.67%，批间精密度CV分别为1.53%、1.14%。线性范围为0.00～218.36 ng/mL，临床可报告范围为0.12～1642.56 ng/mL，随机抽取的20例健康体检样本的测定结果95%在参考值范围（0.00～5.00 ng/mL）内。 结论 该试剂盒的胶乳免疫比浊法测定肌酸激酶同工酶性能符合要求，可满足临床测试要求。

[关键词] 肌酸激酶同工酶;质量法;试剂性能评价;胶乳免疫比浊法;准确度;精密度;线性范围;参考范围

[中图分类号] R446.1          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）29-0137-04

[Abstract] Objective To evaluate the performance of CKMB Mass Assay Kit（latex immunoturbidimetry） of Beijing Strong Biotechnologies， Inc（BSBE）. Methods From May to December 2019， Toshiba 2000FR full-automatic biochemical analyzer was used to test the accuracy， precision， linear range， dilution multiple， blank and detection limit， maximum valid dilute double， clinical reportable range and reference range of creatine kinase isoenzyme for experimental performance verification. In terms of statistical method， linear correlation and regression analysis was adopted. Results In the accuracy verification of CKMB Mass Assay Kit of BSBE， the relative deviation of the measured value and the fixed value was respectively 0.62% and -2.89%， the intra-batch precision（CV） was respectively 1.29% and 0.67%， and the inter-batch precision（CV） was respectively 1.53% and 1.14%. The linear range was from 0.00 to 218.36 ng/mL， and the clinical reportable range was from 0.12 to 1，642.56 ng/mL. 95% of the measured results of 20 randomly selected health checkup samples were within the reference value range（0.00-5.00 ng/mL）. Conclusion The latex immunoturbidimetry of the assay kit meets the requirements for creatine kinase isoenzyme determination and it can meet the requirements of clinical test.

[Key words] Creatine kinase isoenzyme; Mass method; Evaluation of reagent performance; Latex immunoturbidimetry; Accuracy; Precision; Linear range; Reference range

磷酸肌酸激酶主要存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，其同工酶（CKMB）是心肌损伤的特异而敏感的指标，曾认为是诊断心肌梗死和心肌炎的金指标[1]。目前实验室CKMB的检测方法常为酶法（免疫抑制法），此方法容易出现结果与临床不符的情况。CKMB质量法，其原理是利用单克隆抗体技术和化学发光或荧光免疫的方法直接检测CKMB的质量浓度，所以可以从根本上解决酶法的不足。胶乳免疫比浊法在临床上测试不需要特殊仪器设备，其检测方法具有简便、无污染且测试速度快等优点。本研究对北京九强胶乳免疫比浊法测定的肌酸激酶同工酶的试剂盒进行性能评价，以验证该产品的可靠性和临床适用性。

1材料与方法

1.1仪器及试剂

1.1.1 仪器  东芝公司生产的TBA2000FR全自动生化分析仪。

1.1.2试剂、校准品和质控品  方法学评价所用试剂、校准品和质控品均由北京九强生物科技股份有限公司提供，质控品1和质控品2（批号：19-0114），质量法所用试剂（批号：19-0114），校准品（批号：19-0114）。

1.2 检测原理

样本中的肌酸激酶同工酶（CKMB）与超敏化的抗肌酸激酶同工酶（CKMB）抗体胶乳颗粒试剂反应，形成免疫复合物，在660 nm波长处检测其吸光度的变化，其变化程度与样本中的肌酸激酶同工酶（CKMB）浓度呈正比。

1.3 检测参数

样本体积为10 μL，试剂1（R1）为150 μL，试剂2（R2）为50 μL，采用两点终点法，反应方向为向上反应，主波长为660 nm，无副波长，反应温度为37℃，读点时间：22点/33点。

1.4 方法

1.4.1准确度  重复测定高低质控样本，检测4次，计算其相对偏差。当相对偏差≤10%时，说明该试剂有良好的准确度。

1.4.2精密度  根据CLSI EP5-A2[2]要求，选择高低浓度样本进行批内精密度和批间精密度的测定。批内精密度：取高、低值两个水平的患者混合血清各1支重复检测20次，计算均值与标准差，求得变异系数;批间精密度：取高、低值两个水平的质控各1支，分成5份，每天测4次，连续测5 d，计算均值与标准差，求得变异系数。

1.4.3线性范围  根据CLSI EP6-A[3]要求，取接近检测上限的血清标本（H）与去离子水（L），按照浓度梯度 H、4 H■1 L、3 H■2 L、2 H■3 L、1 H■4 L、L 等距稀释，每个浓度梯度测定 2 次，以实测均值为 Y，理论值为X，求出线性回归方程，并计算Pearson相关系数r值，判定要求：R2≥0.975，0.97≤A≤1.03。

1.4.4空白检测限  连续检测去离子水10次，计算均值及标准差，以均值+3×SD对应的浓度为试剂空白检测限。

1.4.5最大稀释倍数 选取分析范围内高浓度标本，要求外观清澈，无溶血，无黄疸，无脂血。用原厂技术资料申明的稀释液进行2、4、8、16倍稀释。将检测结果与稀释后的预期值进行比较，计算稀释回收。稀释回收率=（实测值/预期值）×100%。结果评价标准：稀释测定结果与理论结果的差异应<±1/2 CLIA'88允许变异（如果CLIA'88上未规定按照 10%的标准处理）。

1.4.6临床可报告范围  空白检测限～分析测量范围上限（已验证的线性范围上限×最大稀释倍数）。

1.4.7参考范围 随机选择2019年5月26日广州中医药大学顺德医院健康体检的20份标本进行检测。其中男、女各10例，年龄分布合适。根据NCCLS C28-A2[4]要求，如果20个参考个体中不超过2个标本的检测值在验证的参考限之外，厂商或提供参考区间的实验室报告的 95%参考区间可以接受。如果出现3个以上超出界限，再选择20个标本进行验证，若少于或等于2个检测值超过原始参考值，则可接受，若还有3个超出参考限，需要重新检查各种条件，决定是否建立自己的参考区间。

1.5 统计学分析

采用Microsoft excel 2013办公软件进行数据的统计分析。

2 结果

2.1准确度实验评价结果

高低值2个浓度质控品的相对偏差分别为0.62%、-2.89%，两个相对偏差均符合要求。见表1。

2.2 精密度评价实验结果

根据WS/T 420-2013（临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证）[5]的要求，低、高值混合标本的批内精密度CV分别为1.29%、0.67%，其CV未超过 1/4TEa（TEa=30%）即7.5%允许偏差范围，见表2。低、高水平质控品的批间精密度CV分别为1.53%、1.14%，其CV也未超过1/3TEa（TEa=30%）即10%的允许偏差范围，见表3。

2.3 线性范围实验结果

肌酸激酶同工酶的实测值与理论值无明显离群值，该试剂实测值与理论值的线性回归方程为Y=1.0087X-0.1157，R2=0.9992。CKMB在0.00～218.36 ng/mL范围内呈线性，与制造商给定的线性范围的0.00～180 ng/mL相比，该试剂具有较宽的线性范围，见表4、图1。

2.4 空白检测限实验结果

以水空白为样品检测10次后得出空白检测限为0.12 ng/mL。见表5。

2.5 最大稀释倍数实验结果

将检测值为 205.32 ng/mL的样本进行2、4、8、16倍稀释，将检测结果与稀释后的预期值进行比较，计算回收率和相对偏差。当稀释16倍时相对偏差为-10.60%，大于10%的标准，所以稀释16倍不可接受，因此该项目的最大稀释倍数为8倍。

2.6 临床可报告范围实验结果

由表5～6可知，该试剂的临床可报告范围为0.12～1642.56 ng/mL。

2.7 参考范围评价实验结果

通过对上述20份样本進行检测，测定结果中有19个结果均在参考区间（0.00～5.00 ng/mL）内，有95%的符合率，证明厂家提供的参考区间仍适用。

3 讨论

CK在人体内存在三种类型，分别为CKMM、CKBB和CKMB，CKMM主要存在于骨骼肌和心肌，CKBB主要存在于大脑，CKMB主要存在于心肌，心肌损伤严重时释放入血。因此，CKMB是诊断急性心肌梗死的重要指标[6-7]。

肌酸激酶同工酶（CKMB）在心肌损伤的酶学检测中具有重要意义，其具有较高的特异度，且受到临床的广泛关注。目前，CKMB的检测方法包括免疫抑制法、电泳法、酶质量法等，其中以免疫抑制法最为常用，其原理是应用单克隆抗体与CK中的M亚基结合抑制 CKMM（主要在骨骼肌中）及CKMB中M亚基活性的特点，再通过速率法进行CK活性测定。但由于生理性、病理性等因素的影响，常使CKMB出现活性假性升高，干扰临床对心肌损伤的诊断[8]。如CK-BB、肌激酶（MK）、巨CK-1、免疫球蛋白结合 CK（macro CK）、线粒体CK（mit CK）均能造成血中CKMB活性测定结果的误差，所以临床上经常看到CKMB>CK的化验结果，可见CKMB活性的测定有一定的局限性[9]。一般血清CKMB活性大于CK在恶性肿瘤、急性脑血管病、小儿肺炎、小儿轮状病毒性肠炎、带状疱疹、有机磷中毒等疾病中存在[10]，只有避免此类结果的出现才能更好地迅速诊断疾病，减少对临床造成的干扰。本实验使用的质量法试剂盒是建立在单克隆抗体直接识别CKMB抗体的实验原理上的，抗体的特异性决定其不受CKMM、CKBB、巨CK-1以及线粒体CK的干扰，同时避免了蛋白失活造成的误差，诊断特异性较抗体酶抑制法有显著的提高[11]。有研究表明，加入干扰物（CK-MMXK-BB）前后CKMB质量未见明显变化，说明其不受非典型CK、巨CK-1和CKBB等多因素的影响[12]。其次，由于酶的活力具有一定的衰减性[13]，活性的检测结果相对来说会存在一定的偏差。但CKMB质量不受酶老化的影响，其检测特异性高于CKMB活性[14]。同时也有研究表明CKMB质量检测优于CKMB活性检测，特别是对AMI患者和有较明显感染的心肌缺血患者的诊断[15]。因此，CKMB质量法的诊断效能会大于CKMB活性的诊断效能，CKMB质量法检测结果可作为心肌炎特异和可靠的诊断依据[16]。因此对于诊断心肌梗死[17]、心肌炎[18]等患者来说，CKMB质量法优于常规的酶法。