不同药剂对拟茎点霉菌的室内毒力测定

李小艳 刘翊泽 杨红 王林

摘要    拟茎点霉菌可引起植物发病。为筛选较好的防治药剂及其浓度，本研究采用室内抑菌法对6种药剂进行了测定。结果表明，苯甲·氟酰胺悬浮剂、唑醚·代森联水分散粒剂、寡糖·乙蒜素微乳剂、吡唑醚菌酯悬浮剂4种药剂对拟茎点霉菌有较好的抑制效果，其中，苯甲·氟酰胺悬浮剂抑制效果最好，唑醚·代森联水分散粒剂和吡唑醚菌酯悬浮剂的抑制效果次之，寡糖·乙蒜素微乳剂的抑制效果最差。

关键词    拟茎点霉菌;防治药剂;室内抑菌法;室内毒力测定

中图分类号    S482        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）22-0070-04                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    Phomopsis sp. can cause plant diseases. In order to screen better control agents and concentration， this study used the indoor antibacterial method to determine the six agents. The results showed that 4 kinds of medicaments including benzo·fluoroamide suspension， oxazofet·dysenlian water dispersible granules， oligosaccharide·allicin microemulsion， pyraclostrobin suspension had good inhibitory effects， among which， benzo·fluoroamide suspension had the best inhibitory effect， followed by oxazofet·dysenlian water dispersible granules and pyraclostrobin suspension， oligosaccharide·allicin microemulsion had the worst inhibitory effect.

Keywords    Phomopsis sp.; control agent;indoor antibacterial method; indoortoxicity test

擬茎点霉属为半知菌亚门腔孢纲球壳孢目中的真菌属，其形态学特征主要为一个暗色真子座质的载孢体，能够产生甲（α）型和乙（β）型2种分生孢子[1]。其分布非常广泛，尤其在热带和亚热带地区。拟茎点霉作为一种重要的植物病原菌，主要危害被子植物和裸子植物，侵染植物的枝叶、果实，但很少侵染根，可引起如叶枯、枝枯、果腐、根腐、溃疡、烂茎、树皮坏死等多种病害[2-3]。此外，由于拟茎点霉属无宿主特异性，因而在许多染病植物中均可分离，如茄子褐纹病[4]、大豆拟茎点霉茎枯种腐病[5]、芦笋茎枯病[6]、柑橘黑点病[7]等病害。

前人对拟茎点霉属病害的研究大多集中于生物学特性、分类地位、病原菌分离鉴定、内生菌的治病症状等方面[8]，对病原菌与寄主相互作用的过程、致病机理及抗病性等方面的研究相对较少[9-10]。当前拟茎点霉属菌物引起了人们越来越多的关注，国内外对其病害分子遗传及基因功能的研究也日益增多。如Anco等[11]首次将绿色荧光蛋白通过原生质体转入到P. viticola中，为分析致病侵染进程提供了便利。崔友林[12]基于国外抗病资源方面的研究，对我国大豆抗拟茎点种腐病的分离物进行序列分析，得出结论后应用于抗性鉴定，并为Phomopsis longicolla的抗病资源和抗病品种选育方面提供参考。

随着经济水平、生活质量的不断提高，人们对身体健康的重视程度也越来越高。尤其在蔬果方面，人们不仅要求品种多样化，而且对蔬果品质和安全也提出了更高要求。拟茎点霉菌作为一种真菌，对植物会产生病害，且影响较大，因而给种植户带来了困扰，同时也造成了极大的经济损失。王井田等[13]于2013年研究拟茎点霉菌侵染规律，通过田间和镜检试验表明，该菌在越冬过程中多以菌丝体或孢子器附着于病枝、病残体和残留果梗上，待到次年春季孢子便会大面积传播，以侵染幼果为主。该病症早期不易被发现，直到果实成熟或采收后才开始缓慢显现。

目前，市场上尚未有仅针对拟茎点霉菌的药剂。本文采用室内抑菌法，研究化学药剂醚菌·啶酰菌悬浮剂、苯甲·氟酰胺悬浮剂、唑醚·代森联水分散粒剂、吡唑醚菌酯悬浮剂和生物制剂寡糖·乙蒜素微乳剂、哈茨木霉菌可湿性粉剂及其不同浓度对拟茎点霉菌的抑制效果，意在筛选出对拟茎点霉菌效果较好的药物及其浓度，为农作物栽培生产提供更明确的方向。

1    材料与方法

1.1    试验材料

供试菌种为拟茎点霉菌，由四川省自然资源研究所分离纯化鉴定。

供试培养基为PDA培养基。

供试药剂为醚菌·啶酰菌悬浮剂（15 mL/袋，巴斯夫欧洲公司）、苯甲·氟酰胺悬浮剂（15 mL/袋，巴斯夫欧洲公司）、唑醚·代森联水分散粒剂（20 g/袋，山东邹平农药有限公司）、寡糖·乙蒜素微乳剂（10 g/袋，海南正业中农高科股份有限公司）、哈茨木霉菌可湿性粉剂（100 g/袋，美国拜沃股份有限公司）、吡唑醚菌酯悬浮剂（100 mL/瓶，山东康乔生物科技有限公司）。

1.2    试验方法

1.2.1    拟茎点霉菌的活化。在超洁净工作台中用接种环从容器挑出一个菌饼，放在PDA培养基中央，用封口膜将其封好，在温度为25 ℃的培养箱中培养1周。

1.2.2    药剂配制。将6种药剂各配制出5种浓度供后续试验使用，共设30个处理，即醚菌·啶酰菌悬浮剂4.00 mL/L（A1）、2.00 mL/L（A2）、1.00 mL/L（A3）、0.50 mL/L（A4）、0.25 mL/L（A5），苯甲·氟酰胺悬浮剂3.560 mL/L（B1）、1.780 mL/L（B2）、0.890 mL/L（B3）、0.445 mL/L（B4）、0.223 mL/L（B5），唑醚·代森联水分散粒剂2.660 g/L（C1）、1.330 g/L（C2）、0.665 g/L（C3）、0.333 g/L（C4）、0.1663 g/L（C5），寡糖·乙蒜素微乳剂4.440 mL/L（D1）、2.220 mL/L（D2）、1.110 mL/L（D3）、0.555 mL/L（D4）、0.278 mL/L（D5），哈茨木霉菌可湿性粉剂8.880 g/L（E1）、4.440 g/L（E2）、2.220 g/L（E3）、1.110 g/L（E4）、0.555 g/L（E5），吡唑醚菌酯悬浮剂4.000 mL/L（F1）、2.000 mL/L（F2）、1.000 mL/L（F3）、0.500 mL/L（F4）、0.250 mL/L（F5）。其中，处理 A3、B3、C3、D3、E3、F3为说明书推荐浓度。

1.2.3    药剂初筛。用8 mm打孔器沿活化好的含拟茎点霉菌的PDA培养基边缘处打孔，用镊子取菌饼接于平板中央，培养1 d后，在菌饼2 cm左右处呈三角形放置3个牛津杯，在牛津杯中加入1.2.2中配制好的6种药剂推荐浓度溶液各100 μL，每种浓度3个重复，封口后置于25 ℃培养箱中培养3 d，观察拟茎点霉菌生长情况，测量抑菌圈半径，并记录。处理数据时，直径=半径×2。

抑菌效果评价标准：- 表示无抑菌圈;+ 表示抑菌圈直径为8～10 mm;++ 表示抑菌圈直径为10～12 mm;+++ 表示抑菌圈直径大于12 mm。

1.2.4    有抑菌效果的药剂室内毒力测定。将初筛后有抑菌效果的药剂配制的5个浓度梯度按照1.2.3中的方法加入牛津杯中，封口后置于25 ℃培养箱中进行培养，观察拟茎点霉菌生长情况，在培养后的第3天测定抑菌圈半径，并记录。

1.3    数据分析

以药剂浓度为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，用Excel 2017绘制出散点图，根据曲线走向进行分析。

2    结果与分析

2.1     药剂初筛结果

在牛津杯中加入配制好的6种药剂推荐浓度，置于25 ℃培养箱中培养3 d，结果显示，醚菌·啶酰菌悬浮剂和哈茨木霉菌可湿性粉剂对拟茎点霉菌几乎没有抑制作用，牛津杯周围长满真菌，无抑菌圈，如图1（a）（e）所示。剩下的4种推荐浓度药剂对拟茎点霉菌均有抑制作用，如图1（b）（c）（d）（f）所示，其中寡糖·乙蒜素微乳剂的抑菌效果最低，抑菌圈半径较小;唑醚·代森联水分散粒剂和吡唑醚菌酯悬浮剂的抑菌效果中等，抑菌圈明显;苯甲·氟酰胺悬浮剂的抑菌效果比较好，有明显且较大的抑菌圈（表1）。

2.2    药剂室内毒力测定结果

根据测量的第3天抑菌圈半径计算出直径（表2），再以药剂浓度为自变量，以抑菌圈直径为因变量，利用Excel 2017处理记录数据，得到4种药剂对拟茎点霉菌的室内毒力曲线图（图2）。结果表明，4种药剂抑菌效果最佳的为苯甲·氟酰胺悬浮剂，其次是唑醚·代森联水分散粒剂和吡唑醚菌酯悬浮剂，效果最低的为寡糖·乙蒜素微乳剂。在配制药剂的不同浓度方面，仅苯甲·氟酰胺悬浮剂出现了最大抑菌圈，其最佳抑制浓度为0.890 mL/L，低于或高于这个浓度对拟茎点霉菌的抑制效果均降低;唑醚·代森联水分散粒劑、寡糖·乙蒜素微乳剂、吡唑醚菌酯悬浮剂的最大抑菌圈分别出现在浓度为2.660 g/L、4.440 mL/L、4.000 mL/L时。在相同浓度下，吡唑醚菌酯悬浮剂和唑醚·代森联水分散粒剂的抑制效果几乎始终大于寡糖·乙蒜素微乳剂。在低浓度情况下，吡唑醚菌酯悬浮剂的抑菌效果强于唑醚·代森联水分散粒剂;而高浓度下两者抑菌效果相近。

3    结论与讨论

本研究采用牛津杯抑菌圈法先从6种防治真菌的药剂中筛选出了4种对拟茎点霉菌有抑制效果的药剂。其中，醚菌·啶酰菌悬浮剂和哈茨木霉菌可湿性粉剂基本无抑制效果。醚菌·啶酰菌悬浮剂由啶酰菌胺和醚菌酯混配制成，两者均为呼吸抑制剂，通过双重抑制病原菌呼吸，达到防治效果，它主要是针对草莓、黄瓜等作物的白粉病及葡萄穗轴褐枯病，对拟茎点霉菌几乎没有抑制效果。生物杀菌剂哈茨木霉菌可湿性粉剂的作用机制是在植物的某些部位快速生长，以此占据生态位，从而达到预防病原菌侵染的效果，如植物的根、叶等周围。哈茨木霉菌可湿性粉剂也可以作用于病原菌的细胞，但主要是作为生防菌来预防病害，因而对已经生长出的病原菌治疗效果较差。

针对有抑制效果的药剂苯甲·氟酰胺悬浮剂、唑醚·代森联水分散粒剂、寡糖·乙蒜素微乳剂、吡唑醚菌酯悬浮剂，分别研究了其5种不同浓度对拟茎点霉菌的室内毒力。结果表明，整体上4种药剂的抑菌效果从小到大的顺序依次为寡糖·乙蒜素微乳剂<唑醚·代森联水分散粒剂<吡唑醚菌酯悬浮剂<苯甲·氟酰胺悬浮剂，其中以浓度为0.890 mL/L的苯甲·氟酰胺悬浮剂的抑菌效果最强。苯甲·氟酰胺悬浮剂为苯醚甲环唑和氟唑菌酰胺的混配制剂，是一种广谱杀菌剂，不仅可用于防治多种作物上的多种真菌性病害，还具有内吸传导性、保护和治疗活性，对此类病害有较长的持效期及较好的治疗效果。唑醚·代森联水分散粒剂由5%吡唑醚菌酯和55%代森联组成，既具有吡唑醚菌酯对多种真菌性病害的治疗效果，也具有代森联抑制真菌孢子萌发和干扰芽管发育生长的作用。从总体趋势上看，吡唑醚菌酯悬浮剂的抑制效果要比唑醚·代森联水分散粒剂更稳定。因此，对于防治由拟茎点霉菌引起的真菌病害，可优先选择吡唑醚菌酯悬浮剂。寡糖·乙蒜素微乳剂由氨基寡糖素和乙蒜素2种活性物质组成，其中氨基寡糖素属植物诱导抗病剂，它可以直接或间接抑制病原菌。直接抑制是通过释放一些寡聚糖素，参与对病原菌的抑制作用;间接抑制则是通过激发植物自身来产生一系列防御反应，从而抑制病原菌生长。乙蒜素抑制菌体代谢是通过其结构中的（S-S=O=O）基团与菌体中含-SH基的物质反应。寡糖·乙蒜素微乳剂主要是针对引起棉花枯萎病的真菌性病害，研究表明，当使用浓度高于推荐浓度，其对拟茎点霉菌的抑制效果也较好。尽管根据配制的药剂浓度显示唑醚·代森联水分散粒剂、寡糖·乙蒜素微乳剂和吡唑醚菌酯悬浮剂对拟茎点霉菌的抑制效果比苯甲·氟酰胺悬浮剂弱，但3种药剂均没有出现最大抑菌圈，且抑菌圈与浓度成正相关。若不考虑苯甲·氟酰胺悬浮剂，本试验结果与董克锋等[14]和岳清华等[15]的研究结果基本一致。唑醚·代森联水分散粒剂、寡糖·乙蒜素微乳剂和吡唑醚菌酯悬浮剂均可作为拟茎点霉菌的预防药剂。

4    参考文献

[1] SUTTON B C.The Coelomycetes[M].London：CABI，1980.

[2] 劳佳萍.植物内生真菌拟茎点霉生物多样性研究[D].杭州：浙江大学，2007.

[3] UECKER F A.A world list of Phomopsis names with notes on nomenclature，morphology and biology[J].Mycol Mem 1988，13：1-231.

[4] 马珂.茄褐纹病菌生物学特性、致病性及寄主抗性机制的研究[D].合肥：安徽农业大学，2005.

[5] 崔友林，段灿星，丁俊杰，等.一种新发生的大豆茎枯病病原菌鉴定[J].中国油料作物学报，2010，32（1）：99-103.

[6] 孙燕芳，郑金龙，刘巧莲，等.15种药剂对芦笋茎枯病病原菌的毒力测定[J].热带农业科学，2013，33（4）：71-75.

[7] 阳廷密，邓崇岭，门友均，等.8种农药对柑橘拟茎点霉毒力测定及田间防治试验[J].中国南方果树，2014，43（2）：52-53.

[8] 张岳平，瞿华香，罗绍春，等.一些重要作物拟茎点霉属病原生物学及致病机制研究概况[J].中国农学通报，2013，29（33）：327-332.

[9] DUVNJAK T，VRATARIC M，SUDARIC A，et al.Pathogen-plant interaction：Phomopsis longicolla strain pathogenicity[J].Alps-Adria Scientific Workshop，2007（35）：361-364.

[10] SMITH S，FENN P，CHEN P，et al.Inheritance of resistance to Phomopsis seed decay in PI360841 soybean[J].Journal of Heredity，2008（99）：588-592.

[11] ANCO D J，KIM S，MADDEN L V，et al.Transformation of Phomopsis viticola with the green fluorescent protein[J].My-cologia，2009，101（6）：853-858.

[12] 崔友林.大豆莖枯病病原菌鉴定及3种检疫性大豆病原菌适生性分析[D].北京：中国农业科学院，2009.

[13] 王井田，刘达富，刘允义，等.猕猴桃果实腐烂病的发病规律及药剂筛选试验[J].浙江林业科技，2013，33（3）：55-57.

[14] 董克锋，岳清华，高勇，等.蓝莓拟茎点霉枝枯病药剂防治试验[J].中国森林病虫，2015，34（6）：44-46.

[15] 岳清华，高勇，廖甜甜，等.6种杀菌剂对5种蓝莓枝枯病原菌的室内毒力测定[J].山东农业科学，2015，47（6）：101-103.