卵泡颗粒细胞黄体化过程中的基因表达、孕酮合成及与LDL的作用

张 晗，于 磊

（中国医学科学院 医学实验动物研究所人源化动物模型平台，北京100021）

黄体（corpus luteum）在雌性哺乳动物生殖过程中发挥关键作用，是维持妊娠所必需的。黄体化在滤泡破裂前已开始，过程中受多种因素的控制，也伴随多种激素和基因的变化。文章对黄体化过程中主要激素（孕酮）的变化可能涉及的分子机制进行阐述。

1 卵泡颗粒细胞及其卵泡发育过程

卵泡颗粒细胞（granulosacell，GC）是动物生殖过程中一类重要的细胞，位于卵细胞周围，是构成卵泡的重要组成部分。在原始卵泡阶段，颗粒细胞为单层扁平状，包绕着卵母细胞；在初级卵泡阶段，颗粒细胞变为柱状；在次级卵泡阶段，颗粒细胞不断增生和分裂，变为2～6层细胞，并且出现卵泡腔（卵泡液是由颗粒细胞分泌的）。颗粒细胞的数量及分泌雌激素和孕激素的功能与卵泡发育状况呈正相关，卵泡体积愈大颗粒细胞数量愈多，产生的激素值愈高。卵泡是卵巢的基本功能单位。卵巢卵泡发育是一个连续而复杂的变化过程，经历卵泡发育的启始、募集、选择、优势化、排卵和黄体化等过程。一般根据其形态变化划分为以下几个阶段：原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡。卵泡的生长和发育也是一个高度协调的生理过程，受多种因素的影响和控制，原始卵泡到成熟卵泡的发育过程中，大部分卵泡闭锁，只有少部分发育为优势卵泡后排卵，形成黄体。

2 黄体的发生

2.1 黄体的来源

黄体是由排卵后的膜黄体细胞和颗粒黄体细胞转化而来的。成熟卵泡排卵后残留在卵巢内的卵泡壁塌陷，卵泡膜内的血管和结缔组织伸入颗粒层。在黄体生成素（LH）的作用下，卵泡壁的细胞体积增大，分化为一个体积很大并富含血管的内分泌细胞团，新鲜时呈黄色，称为黄体。颗粒细胞分化为粒黄体细胞（granular lutein cell），膜细胞分化为膜黄体细胞（theca lutein cell）。粒黄体细胞较大，呈多角形，染色较浅，数量多；膜黄体细胞较小，呈圆形或多角形，染色较深，数量少，分布于黄体的周边。这两种细胞具有分泌类固醇激素细胞的结构特征，细胞内有丰富的滑面内质网和管状嵴的线粒体，还有脂滴和黄色脂色素。黄体是一个短暂的内分泌组织，主要分泌孕酮。哺乳类动物黄体中有大小和形态不同的细胞，大量研究证实，黄体中有两种黄体细胞：围绕在卵细胞周围的颗粒细胞在排卵后形成大黄体细胞（又称大颗粒黄体细胞），泡膜细胞形成小黄体细胞（又称小泡膜黄体细胞）。大黄体细胞不再发生分裂，但细胞体积增大；小黄体细胞可继续增生，细胞数不断增加，而细胞体积无变化。有研究者发现，在黄体中期及中期后有一部分大黄体细胞转变为小黄体细胞，有部分小黄体细胞也会转变为大黄体细胞；还有研究者发现，随着黄体期进展，大细胞转变为小细胞，呈纤维母细胞样的形态。据B.Fisch等［1］报道，在黄体期不同阶段大、小黄体细胞的比例不同，黄体早期以大黄体细胞为主，随着黄体期的进展大黄体细胞逐渐减少。大黄体细胞合成较多量的孕酮，一般孕酮量比小黄体细胞合成的孕酮量高2倍。这种差异在羊和猴上更为显著，可达12～30倍。G.D.Niswender等［2］认为，大黄体细胞的寿命是短暂的，一般只有2～5 d，一旦黄体发生退化，80%以上的黄体细胞将消失。

2.2 黄体化生物学变化

以往人们普遍认为排卵后才发生卵巢颗粒细胞的黄体化，但越来越多的学者研究证明，黄体化也可以发生于排卵前［3］。排卵前LH峰的出现使颗粒细胞和膜细胞在形态和生理功能上都发生了一系列的变化，分别转化为大黄体细胞（颗粒黄体细胞）和小黄体细胞（膜黄体细胞），此过程即为黄体化。尽管生理状态下黄体化发生在排卵之后，但黄体化并不依赖于排卵的发生。黄体化在LH峰之后即开始，即便排卵失败卵泡也能发生黄体化。这表明排卵和黄体化虽由同样的促性腺激素诱导，但这两个过程至少在一定程度上是可以相互独立的［4］。在黄体形成过程中伴随着很多生物学和分子生物学变化，甾类激素合成灵敏调节蛋白（StAR）将细胞质中的游离胆固醇运送至线粒体，并由线粒体外膜转运至内膜。细胞色素P450侧链裂解酶（P450scc）定位于线粒体内膜，负责将胆固醇的侧链催化断裂，形成孕烯醇酮（pregnenolone）。在排卵前的卵泡液中孕酮浓度很低，合成孕酮所需要的P450scc和3β羟类固醇脱氢酶（3-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ-5-4 isomerase，3β-HSD）的mRNA表达量暂时性降低，排卵后和黄体化期间mRNA表达量和3β-HSD酶活性升高，随着黄体的发育和成熟卵巢孕酮合成量急剧增加。导致这一结果的主要原因是StAR和P450scc表达量增加［5］。当黄体完全功能化时胆固醇脂酶、P450scc、3β-HSD活性进一步提高。近来的研究结果表明，StAR的出现与孕酮的合成在时空上有一致性，可见StAR是黄体的功能指标之一［6］。在排卵后颗粒细胞很快就获得P450scc，因此可以用这个酶的出现作为黄体化的标志［7］。

2.2.1 孕酮的生物合成 孕酮合成的底物是胆固醇（cholesterol）。在正常条件下，大部分胆固醇在肝脏内合成，再以脂蛋白的形式被运输到类固醇生成组织（如肾上腺皮质、卵泡、黄体和睾丸等）。所有类固醇的合成都依赖于胆固醇被运输至线粒体，然后从线粒体外膜被转运至内膜，在那里胆固醇的侧链被胆固醇侧链断裂酶复合体（cholesterol sidechain cleavage enzyme complex）切开后形成孕烯醇酮（pregnenolone）。将胆固醇运输至线粒体外膜的过程似乎需要一个完整的细胞骨架，如果微管和微丝功能受到抑制则阻止了线粒体内胆固醇的积累。细胞骨架蛋白的磷酸化状态可能影响类固醇的运输速率。另外，类固醇结合蛋白也在胆固醇运输至线粒体的过程中发挥重要作用。类固醇合成途径中的限速步骤是将胆固醇从线粒体外膜转运到内膜的过程。目前已经知道类固醇合成StAR在这个过程中是不可或缺的［8］。StAR是由含有一个线粒体靶向序列的前体经过转录后修饰所形成。Y.Tsujishita等［9］的研究表明，StAR将胆固醇转运至线粒体内膜，StAR蛋白的C末端被证实在转运胆固醇进入线粒体内膜过程中发挥重要作用。这个区域被称为StART结构域（StAR-related lipid tansfer domains）。根据该模型，StAR蛋白的结构允许胆固醇分子通过，StART结构域可以改变线粒体膜，并含有一个疏水性胆固醇结合通道，每次转运一个胆固醇分子进入内膜。位于类固醇生成细胞线粒体膜上的外周型苯二氮受体也被证实在胆固醇运输过程发挥作用。在类固醇生成细胞内删除该受体基因，使细胞类固醇合成急剧下降，而这可以被重新向细胞引入该受体所翻转，该受体的内源性配体已经被证实对人绒毛膜促性腺激素（hCG）刺激的类固醇生成是必需的［10］。

胆固醇一旦进入线粒体内，其内膜上的胆固醇侧链断裂，从而形成孕烯醇酮。然后它被运送到紧挨着线粒体的滑面内质网，内质网里的3β-HSD将孕烯醇酮转变成孕酮［11］。

2.2.2 StAR StAR是B.J.Clark等［12］于1994年从小鼠MA-10LLeydig细胞株中克隆并纯化出来的一种转运蛋白。在动物体内，StAR广泛分布于卵巢、睾丸、肾上腺、肾脏和脑中。E.Lavaque［13］等研究发现，除了在肾上腺、黄体、睾丸间质细胞和支持细胞等处有StAR表达外，在脊髓的施万细胞，脑内星形胶质细胞，大脑皮层、海马，小脑的颗粒细胞，下丘脑的弓状核等处都有表达。说明StAR的分布不仅局限于类固醇激素细胞。

StAR是激素可诱导的线粒体蛋白，根据分子质量的大小分为三种：32，37，30 kDa。其中32，37 kDa StAR是30 kDa StAR的前体。人和小鼠的StAR基因结构分别为8.0，6.5 kb，都由6个内含子和7个外显子组成，外显子长度一致。StAR在不同物种间有高度的保守性，一致性为85% ～90%，相似性约为90%。蛋白质的端序列是线粒体引导肽，生物活性部位位于C端，可有脂质或胆固醇结合，大约由210个氨基酸组成，称为StAR相关脂质转运结构域（StAR-related lipid transfer，STSRT），第63～188位氨基酸片段有防止蛋白酶水解的作用。StAR是类固醇激素合成中的调节蛋白之一。StAR的分布具有高度特异性，位于类固醇激素细胞的线粒体膜上，参与胆固醇由线粒体外膜向线粒体内膜的转运，然后由P450scc将不溶性胆固醇转化为可溶性孕烯醇酮，是类固醇激素合成过程重要的限速步骤［14］。StAR可介导黄体中孕酮的产生，并且StAR的表达与孕酮形成的水平是一致的［15-16］。在黄体早期StAR蛋白的表达水平低，黄体中期升髙，而黄体晚期又下降，进一步证实了StAR的表达可作为黄体功能的可靠衡量指标。

2.2.3 P450scc 细胞色素P450被称为加单氧酶（monooxygenase）、多功能氧化酶（mixed function oxidase）、羟化酶（hydroxyiase），是一组结构功能相关的超家族同工酶，属于血红蛋白类酶。其中P450scc是动物体内将胆固醇转化成为孕烯醇酮的唯一酶。这个过程需要NADPH通过线粒体的铁氧还蛋白及其还原酶给P450scc提供充足的电子。孕烯醇酮可通过3β-HSD转化为孕酮，脱氢异雄酮通过3β-HSD转化为睾固酮，也可以由孕酮通过CYP17转化为睾固酮，睾酮又通过CYP19转化为17-雌二醇（E2），因此说CYP11、3β-HSD、CYP17、CYP19这几种类固醇代谢酶对动物的性腺类固醇生成起着至关重要的调节作用。

3 LDL的摄入与代谢

3.1 低密度脂蛋（LDL）的结构

LDL由脂质和蛋白质组成，组成的超分子复合物的分子质量达（2.5～3.0）×106Da，含有2 000～3 000个脂质分子。在LDL的中心是一个非极性的核，其中以胆固醇酯为主，其次为一定数量的三酰甘油和一些未酯化的游离胆固醇。包裹在核外面的是亲水的脂性外壳。这个外壳由单层磷脂组成，其中含有大量的游离胆固醇和一个载脂蛋白apo-B100，后者是目前已知最大的单体糖蛋白。由于LDL中不同种类脂分子间具有很强的相互作用力，因此很难将表层与核心成分彼此分离。有报道称，在LDL中存在一个疏水的中间层，它由磷脂酰基链、游离胆固醇、一些胆固醇酯分子和疏水性蛋白质域构成，这一描述解释了中心核脂类与表层间的相互影响［17］。

3.2 LDL参与黄体化过程

很多研究已经证实，StAR和P450scc基因的表达可以由多种因素（如激素、生长因子、转录因子和表观遗传修饰等）在不同的水平进行调控。LDL是黄体类固醇激素合成所需胆固醇的最主要来源之一［18］，可以被大多数物种的黄体细胞所利用。在排卵前的卵泡液中LDL含量极低，排卵后卵泡黄体化，同时黄体内毛细血管增生，卵泡残留的颗粒细胞和膜细胞才接触到大量的LDL。LDL促进孕酮的产生不仅仅归因于LDL作为底物提高胆固醇量，越来越多的研究证实LDL对牛黄体细胞和猪颗粒细胞的孕酮合成具有刺激作用，这种刺激可能是来源于LDL的转录调控作用［19］。也有研究表明，LDL可以上调牛颗粒细胞中StAR和P450scc的mRNA和蛋白质表达，其中LDL对StAR的促进作用可能取决于StAR启动子的上调和转录因子类固醇生成因子1的活性［20］。

4 展望

对活体动物的黄体进行体内研究技术上存在一定的局限性，且单纯以黄体细胞作为研究对象，说明其内分泌的精细调控尚有不全之处。今后可最大化体外模拟体内黄体化过程，进一步研究脂蛋白与黄体化过程的联系，更深入地了解体内卵泡排卵后LDL在颗粒细胞黄体化过程中的作用，进而为提高母畜的繁殖效率提供理论和实践依据。