维生素E对小麦赤霉病菌呕吐毒素积累的调控效应

朱素芹，张语卉，花 辰，李 磊，孙政玺，李 韬

(扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室/江苏省作物基因组学与分子育种重点实验室/ 江苏省作物遗传生理国家重点实验室，江苏扬州 225009)

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的一种真菌性病害，主要发生在长江中下游麦区和东北春麦区[1]，近年来在黄淮冬麦区也流行成灾[2-3]。小麦感染赤霉病后不仅严重影响产量[4-5]，而且感病籽粒中积累的毒素严重降低了籽粒品质[6-7]。禾谷镰刀菌产生的毒素主要有两大类，包括单端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮[8]，其中单端孢霉烯族毒素是有毒的倍半萜化合物，包括A、B、C三种类型，其中B型单端孢霉烯族毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是侵染小麦最重要的致病因子[9]，能够延缓或终止蛋白的生物合成[10]。DON又称呕吐毒素，它和瓜萎镰菌醇(NIV)及二者的衍生物(3ADON、15ADON和4ANIV)等毒素是世界公认的致癌物质[11]，会引起中毒者眩晕、发烧、恶心、腹泻等症状，严重时会引起出血，影响免疫力和生育力等，直接对人畜健康和生命安全构成威胁[12]。近年来市场上面粉厂屡次被检测出DON含量超标，因此严格控制小麦赤霉病的发生、减少DON的积累才能保证食品安全。我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定，小麦粉、小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准为1 000 μg·kg-1[13]。目前，还未发现有效控制 DON 污染的途径。

维生素E是植物体内重要的脂溶性抗氧化剂，包括生育酚和生育三烯酚[14],小麦中的生育酚主要存在于胚中，生育三烯酚存在于果皮和胚乳(含量更高)中[15]。维生素E的生物合成过程主要发生在叶绿体中[16]，莽草酸途径和非甲羟戊酸途径的化合物作为合成的前体，莽草酸途径的产物尿黑酸(HGA)作为底物生成维生素E亲水性头部，非甲羟戊酸途径的产物植基二磷酸(PDP)或香叶基香叶基二磷酸(GGDP)分别是形成生育酚和生育三烯酚的前体[17-19]。维生素E不仅是一种抗氧化剂，也是强自由基清除剂[20]，能及时清除活性氧，防止脂质过氧化的发生[21]。维生素E还可以保护光合系统中蛋白质、色素和多聚不饱和脂肪酸免受氧化损伤[22]。Foyer等[23]推测维生素E可能和其他抗氧化机制共同发挥作用来维持细胞体内氧化还原水平的平衡。

王 旭等[24]研究表明，禾谷镰刀菌侵染小麦籽粒后，导致机体和细胞的脂质过氧化和DNA氧化损伤。Rizzo等[25]发现，在饲料中添加维生素E能降低DON的毒性作用，从膳食中摄入维生素E能缓解DON引起的急性中毒。但迄今为止，禾谷镰刀菌在活体和离体培养条件下，维生素E对DON积累是否有调控作用尚未见报道。因此，本试验在活体条件下解析维生素E对小麦赤霉病病小穗率、籽粒毒素含量的效应，以及在离体条件下解析维生素E对禾谷镰刀菌菌丝生长、DON含量和DON合成关键基因Tri5表达的影响，评价维生素E对DON积累的效应，以期为利用维生素E防控小麦赤霉病菌毒素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 活体试验材料与方法

1.1.1 小麦材料

试验于2018年10月在扬州大学试验田种植高感小麦赤霉病品种Clark，播种6行，每行15株。

1.1.2 试验所用菌株及其菌液制备

本试验所用菌株为F1312(江苏省农科院陈怀谷研究员提供)。利用灭菌后的接种环挑取纯菌株斜面上的禾谷镰刀菌边缘菌体，接种于灭菌的PDA培养基上，于25 ℃恒温培养5～7 d，用灭菌后直径7 mm的圆形打孔器取8块活化的禾谷镰刀菌菌块放入80 mL灭菌的绿豆汤培养基中以180 r·min-1、26 ℃摇培72～120 h，吸取1 μL 孢子液，滴到血球计数板上，置于显微镜下测定孢子浓度，然后稀释或浓缩到接种需要的浓度(1×105个· mL-1)。

1.1.3 维生素E溶液的制备

自然情况下，小麦籽粒本体维生素E含量的均值为0.352 μg·g-1[26]。吸取100 μL维生素E溶液(相当于1 μg·μL-1)(上海生工生物工程股份有限公司)配制成50 mL的维生素E母液，有机相微孔滤膜过滤维生素E母液，置于4 ℃冰箱保存。配置三个浓度梯度的维生素E溶液，分别为本体含量的1倍(3.5×10-4μg·mL-1)、5倍(17.5×10-4μg·mL-1)、10倍(3.5×10-3μg·mL-1)。

1.1.4 禾谷镰刀菌菌液和维生素E接种及鉴定

采用双花滴注法(bilateral florets inoculation method， BFI)，在小麦扬花期利用医学注射器吸取20 μL制备好的禾谷镰刀菌菌液，滴注在倒五小穗双侧小花的内外颖之间，同时在其上下两侧(倒四、倒六)小穗双侧小花的内外颖之间滴注上述三种浓度的维生素E溶液各20 μL，以只滴注禾谷镰刀菌菌液为对照(CK)，共4个处理，每个处理接种5个穗子，记载接种日期，接种21 d后鉴定感病小穗数，病小穗率=感病小穗数/总小穗数。

1.1.5 籽粒中DON含量的测定

(1)实验仪器：三重四级杆液质联用仪(Thermo Fisher，美国)。

(2)标准液制备：毒素原液DON及三种DON的衍生形态，即3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3A-DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15A-DON)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(D3G)(Fermentek，以色列)，用10%乙腈水配置成100 ppb混标溶液。

(3)样品前处理：样品的前处理方法参照靳梦瞳等[27]的方法。收获后小麦穗脱粒，磨样机磨碎后，称取2 g粉碎样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈/水溶液(84/16,v/v)，迅速涡旋振荡，超声30 min后，离心5 min，吸取2 mL上清液转至新的10 mL离心管，加入150 mg无水硫酸镁，涡旋振荡后吸取上清液转至新的10 mL离心管。再加入1 mL正己烷脱脂后，涡旋离心去除正己烷层，用氮气吹干剩余上清液，最后用乙腈/水溶液(15/85,v/v)定容至1 mL。涡旋并过0.22 μm尼龙滤膜后，进行LC-MS分析。

(4)色谱及质谱条件：色谱及质谱条件参照靳梦瞳等[27]的方法，略有改进。色谱条件：选用ACQUITYUPLCHSST3(2.1×100 mm，1.8 μm)色谱柱，柱温40 ℃，样品温度5 ℃。进样体积为5 μL，流速0.3 mL·min-1。采用流动相(A)甲醇和流动相(B)醋酸铵组成的流动相进行梯度洗脱。洗脱程序：0 min 20%(A)，1.0 min 20%(A)、5.5 min 90%(A)，6.5 min 90%(A)、7.0 min 20%(A)。质谱条件：选择反应监测模式(MRM)检测。曲线脱溶剂管(CDL)温度250 ℃，雾化气体和干燥气体均为氮气，流速分别为3.0、15.0 L·min-1。碰撞气为高纯氩气，碰撞诱导解离压力为230 kPa。

1.2 离体试验材料与方法

1.2.1 含有维生素E的PDA和TBI培养基的配制及禾谷镰刀菌培养

分别在灭菌后的PDA以及TBI培养基[28]中加入小麦本体维生素E含量1倍、5倍、10倍的维生素E溶液，以不添加维生素为对照(CK)，充分混匀并量取20 mL于培养皿中，各处理两个重复，待冷却凝固后，用灭菌后直径7 mm的圆形打孔器取一块活化的禾谷镰刀菌菌块于培养皿的中心位置，最后用无菌封口膜封口并置于25 ℃恒温培养。

1.2.2 禾谷镰刀菌菌丝生长速率的测定

每隔24 h拍照记录菌丝生长速度，用游标卡尺通过十字交叉法测量禾谷镰刀菌菌丝的生长直径，直至菌丝长满培养皿。

1.2.3 含有维生素E的PDA和TBI培养基中DON含量的测定

用消毒后的刀片将培养基切碎，将培养基：ddH2O按1∶1比例置于锥形瓶中，180 rpm摇培30 min后，用双层纱布过滤，收集滤液，利用ELISA试剂盒(Beacon Analytical Systems Inc.)进行测定，具体过程参照厂家说明书。

1.2.4Tri5基因表达量的测定

用灭菌后的镊子挑取禾谷镰刀菌菌丝于液氮中快速研磨，采用Takara Trizol法提取总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用Takara反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)进行cDNA的合成。赤霉菌Tri5以及内参基因Tublin的引物序列参照王亚君等[29]的方法，实时定量PCR(qRT-PCR)具体方法参照产品说明书(TaKaRa,RR047A)。

2 结果与分析

2.1 活体条件下维生素E对小麦赤霉病病小穗率及籽粒中DON含量的影响

活体条件下，不同浓度的维生素E处理均不能降低高感赤霉病小麦品种Clark的病小穗率(表1)，说明维生素E对小麦赤霉病的扩展无 影响。

方差分析表明，接种不同浓度的维生素E后，小麦籽粒中DON含量均与对照呈极显著差异。多重比较结果表明，对照籽粒中DON积累量最高，所有维生素E处理下籽粒中DON含量均显著低于对照，17.5×10-4μg·mL-1维生素E处理下籽粒中DON含量也显著低于3.5×10-4μg·mL-1的维生素E处理，3.5×10-3μg·mL-1维生素E处理与17.5×10-4μg·mL-1维生素E处理下籽粒中DON含量无显著差异，表明适量的维生素E能够显著减少小麦籽粒中DON的积累(表1)。

2.2 PDA培养基上维生素E对禾谷镰刀菌菌丝生长和DON积累的影响

与不添加维生素E的对照相比，添加不同浓度维生素E的PDA培养基上禾谷镰刀菌菌丝的生长速率无明显差异(图1)。多重比较结果表明，不同处理间的禾谷镰刀菌菌丝在同一时间点直径均无显著差异(表2)，说明在PDA离体条件下，添加不同浓度的维生素E对禾谷镰刀菌菌丝的生长无显著影响。

在添加不同浓度维生素E的PDA培养基上培养禾谷镰刀菌，4 d 后测定培养基中积累的DON含量，方差分析表明，不同处理间的DON含量无显著差异(P=0.29)，说明在PDA离体培养条件下，添加不同浓度的维生素E对禾谷镰刀菌中DON含量均无显著影响。

表1 小麦品种Clark在赤霉菌和不同浓度维生素E接种下的病小穗率及籽粒中的DON含量Table 1 DON content in Clark inoculated with F.g. and vitamin E under different concentrations

1 d、2 d、3 d、4 d为离体培养天数；VE0、VE1、VE5和VE10分别表示添加维生素E的浓度为0、3.5×10-4、17.5×10-4和3.5×10-3 μg·mL-1。图2同。

表2 不同维生素E浓度处理下不同时间点PDA培养基上禾谷镰刀菌菌丝的直径Table 2 Hypha growth diameter in PDA medium under different concentrations of vitamin E at different time mm

2.3 TBI培养基上维生素E对禾谷镰刀菌菌丝生长和DON积累的影响

与不添加维生素E的对照相比，添加不同浓度维生素E的TBI培养基上禾谷镰刀菌菌丝生长速率无明显差异(图2)。多重比较结果表明，不同处理间的禾谷镰刀菌菌丝在同一时间点直径均无显著差异(表3)，说明在TBI离体条件下，添加不同浓度的维生素E对禾谷镰刀菌菌丝生长均无显著影响。

图2 不同浓度的维生素E对TBI培养基上禾谷镰刀菌菌丝生长的影响Fig.2 Effect of vitamin E under different concentrations on the growth of hypha in TBI medium

表3 不同维生素E浓度处理下不同时间点TBI培养基上禾谷镰刀菌菌丝的直径Table 3 Hypha growth diameter in PDA medium under different concentrations of vitamin E at different time mm

在添加不同浓度维生素E的TBI培养基上培养禾谷镰刀菌，4 d后测定培养基中积累的DON含量。方差分析表明，不同处理间的DON含量无显著差异(P=0.12)，说明在TBI离体培养条件下，添加不同浓度的维生素E对禾谷镰刀菌中DON含量均无显著影响。

2.4 离体条件下维生素E对 Tri5基因表达量的影响

分别提取在TBI培养基上培养3、4和5 d的禾谷镰刀菌菌丝RNA，进行荧光实时定量PCR(qRT-PCR)。结果表明，在培养3、4和5 d时，添加维生素E培养的菌丝中，Tri5基因的表达量与对照之间均无显著差异；但在培养4 d时，Tri5基因的表达量在维生素E浓度为3.5×10-4和17.5×10-4μg·mL-1的处理之间有显著差异(表4)。

表4 添加不同浓度维生素E的TBI培养基培养4 d 时 Tri5基因的表达量Table 4 Expression level of Tri5 gene at the 4th day in TBI medium with VE

3 讨 论

本研究通过活体和离体试验表明，在活体条件下维生素E能显著减少籽粒中DON含量的积累，并且在一定范围内，随着维生素E浓度的增加，DON含量逐渐减少，说明在活体条件下维生素E处理负调控DON毒素的积累，但不能降低病小穗率，即不能阻止病原菌在穗部的扩展，间接说明禾谷镰刀菌侵染是毒素积累的前提，但病小穗率与毒素积累量没有必然联系。而在离体条件下，不论是在PDA上，还是产毒培养基TBI上，与对照相比，维生素E既不影响菌丝生长，也不能抑制病原菌产毒和下调Tri5基因的表达，说明在离体和活体条件下，维生素E对赤霉菌生长的效应一致，但在产毒效应上有差异，推断禾谷镰刀菌本身缺乏对维生素E的应答能力，维生素E的抗氧化效应没有被激发，而活体上维生素E负调控毒素的产生，很可能是通过调控寄主小麦中相关基因的表达而间接调控禾谷镰刀菌产毒相关基因的表达。Atroshi等[30]和Rizzo等[31]的研究表明，维生素E是脂质抗氧化剂，它可以保护DNA免受DON的有害影响，从另一个角度证明了维生素E对降低DON危害的正面效应。小麦在扬花和灌浆期容易受到禾谷镰刀菌的侵染，导致籽粒中会积累毒素[32]，综合本研究结果，认为植株上用维生素E处理，可以在一定程度上降低或控制毒素积累，为小麦禾谷镰刀菌的毒素防控提供新的选择，对保障食品安全有一定的意义。